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Desenvolvimento de uma metodologia simplificada e generalizada CRISPR-Cas9 para a otimização da produção de enzimas de interesse industrial por bactérias do gênero Bacillus

Processo: 18/13134-9
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de outubro de 2018
Vigência (Término): 30 de novembro de 2018
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
Pesquisador responsável:Frederico José Gueiros Filho
Beneficiário:Patrícia dos Santos Costa
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Bacillus subtilis   CRISPR-Cas9   Engenharia genética

Resumo

A subtilisina serino protease alcalina (AprE) é uma importante enzima exoprotease produzida por Bacillus subtilis que possui importantes aplicações biotecnológicas. Neste sentido, esse projeto pretende o estabelecimento de uma metodologia generalizada baseada no CRISPR para edição do genoma de Bacillus subtilis guiado por gRNA utilizando o sistema Case para realizar a mutação dirigida no promotor de aprE no sentido de impedir que as proteínas repressoras identifique a sua região de ligação no promotor, e com isso não ocorra a repressão da expressão desta protease. Para isso, vamos usar uma Cas9 comercial, com a capacidade de clivagem sem especificidade aumentada, que será complexada às sequências escolhidas (gRNA transcrito in vitro). A introdução do complexo de Cas9 e gRNA criados in vitro, para o interior da célula B. subtilis será via eletroporação. Esse é um dos diferenciais deste projeto: estabelecer as condições para usarmos o complexo ribonucleoproteico feito in vitro para modificar geneticamente a cepa Bacillus subtilis com a finalidade de desrreprimir a expressão do gene aprE. Esse sistema difere daquele baseado em plasmídeos ou vírus com relação à rapidez com que a nuclease pode atuar já que os componentes não precisam ser expressos. Para confirmar a generalidade da metodologia criada a mesma será testada em Bacillus amylloliquefasciens FZB42. Após a obtenção dos mutantes apropriados serão realizadas metodologias estatísticas de otimização de processos para direcionar a fisiologia das cepas no sentido de aumentar ainda mais a produção da proteína de interesse.

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