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Expressão heteróloga em Pichia Pastoris e purificação da toxina His-TEV-Ts5, um componente da peçonha de Tityus serrulatus

Processo: 18/11739-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de outubro de 2018
Vigência (Término): 30 de setembro de 2019
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Farmácia - Análise Toxicológica
Pesquisador responsável:Eliane Candiani Arantes Braga
Beneficiário:Nádia Mayumi Vilela Bartnick Tanaka
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Tityus serrulatus   Pichia pastoris   Expressão heteróloga

Resumo

A expressão heteróloga de proteínas é uma ferramenta muito útil que possibilita a realização de estudos de componentes de difícil obtenção de suas fontes naturais. Um desses componentes é a ±-neurotoxina Ts5, presente na peçonha do escorpião Tityus serrulatus (Ts). Esse escorpião é considerado o mais perigoso dentre as espécies brasileiras, pois é o mais frequentemente envolvido nos casos de acidentes com escorpião no país, inclusive nos que levam a vítima a óbito. O escorpionismo no Brasil é um problema de saúde pública, sendo necessários estudos para melhor compreender esses animais e suas toxinas, assim como para desenvolvimento de antivenenos mais eficazes e com menos efeitos colaterais. O volume de peçonha produzida pelo Ts é muito pequeno e apenas 2% dos seus componentes correspondem à Ts5. Portanto, a expressão heteróloga da Ts5 se apresenta como uma ótima e imprescindível ferramenta para o estudo dessa toxina. O objetivo deste projeto é a expressão dessa toxina em sistema heterólogo de Pichia pastoris e sua purificação para uso em estudos futuros em potenciais aplicações farmacêuticas que essa toxina apresenta. Para isso, o gene sintético da Ts5 será desenhado com uma cauda de poli-histidina N-terminal (como um facilitador da purificação através de cromatografia de afinidade), seguida por um sítio de clivagem da protease TEV (Tobacco Etch Virus), para posterior remoção da cauda e liberação da Ts5 recombinante mais similar à Ts5 nativa. A purificação da Ts5 recombinante será realizada através de diferentes técnicas cromatográficas e sua caracterização estrutural inclui a determinação da massa molecular por espectrometria de massas e a confirmação de sua produção e do local de clivagem pela TEV através de seu sequenciamento N-terminal pelo método de degradação de Edman. Esse trabalho permitirá a realização de novos estudos com a Ts5, principalmente aqueles em larga escala, que necessitam de grande quantidade de proteína. Este será o passo inicial para viabilizar suas aplicações biotecnológicas, como, por exemplo, seu potencial uso como inseticida ou como ferramenta molecular para o estudo de canais para sódio dependentes de voltagem, seu alvo.