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Papel da proteína anti-inflamatória anexina A1 na regulação do inflamassoma NLRP3 em neutrófilos isolados

Processo: 18/13544-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de dezembro de 2018
Vigência (Término): 30 de novembro de 2019
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Morfologia - Histologia
Pesquisador responsável:Cristiane Damas Gil
Beneficiário:Rebeca Donizete Correia da Silva
Instituição-sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Inflamação   Inflamassomos   Anexina A1   Anti-inflamatórios   Neutrófilos   Modelos animais   Técnicas in vitro

Resumo

Os inflamassomas são plataformas citoplasmáticas que possuem em comum um domínio de oligomerização (NOD) em sua estrutura e ativados por diversos patógenos, bem como DAMPs (padrões moleculares associados ao dano) e irritantes ambientais. O inflamassoma NLRP3 é o membro mais estudado da família de receptores NLRPs e sua plataforma é constituída pelo adaptador ASC e caspase-1. Esse complexo proteico é capaz de reconhecer vários microrganismos, por meio da ativação de receptores na membrana celular, tais como TLR-2 e TLR-4, receptores de lectina (dectin-1) e do tipo NOD, desencadeando uma resposta pró-inflamatória via fator nuclear kappa B (NFºB) e/ou via NLRP3, com produção de citocinas (IL-1±, IL-1² e TNF-±) e quimiocinas. A liberação de mediadores pró-inflamatórios induz a migração de células imunes e, consequente resposta inflamatória, que pode ser protetora ou deletéria, a depender do grau da resposta imune e das substâncias envolvidas. Nesse contexto, a proteína anexina A1 (ANXA1) desempenha um papel significante no controle da cascata inflamatória, especialmente relacionada à regulação de IL-1², mas sua relação com a via do inflamassoma NLRP3 não foi estabelecida. Objetivo: Avaliar em estudos in vitro, o papel da proteína anti-inflamatória ANXA1 na regulação do inflamassoma NLRP3. Métodos: Camundongos C57BL/6 selvagens (WT) e nocautes para a ANXA1 (ANXA1-/-) receberão injeção i.p. de carragenina a 0,3% e, após 3 horas, será coletado o lavado peritoneal (população de neutrófilos > 95%). Os neutrófilos WT e ANXA1-/- serão estimulados com lipopolissacarídeo (LPS), seguido de nigericina ou ATP, agonistas do NLRP3. Além disso, para verificar o efeito exógeno da ANXA1, neutrófilos serão pré-tratados com o peptídeo mimético da ANXA1, Ac2-26, e em seguida receberão os agonistas do NLRP3. As seguintes análises serão realizadas: western blotting e Elisa para mensurar a liberação de IL-1² e caspase-1; imunofluorescência para detectar a co-localização do NLRP3, ASC e ANXA1; ensaio de liberação da lactato desidrogenase (LDH) para detectar a viabilidade celular. Os resultados contribuirão para um melhor entendimento do papel da ANXA1 na resposta inflamatória, bem como sua relação com a via do NLRP3, indicando possíveis alvos terapêuticos.