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Avaliação de métodos de delivery de CRISPR-Cas9 em células da linhagem THP-1 para edição genômica do gene PPAR

Processo: 18/23089-0
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Mestrado
Vigência (Início): 01 de março de 2019
Vigência (Término): 31 de agosto de 2019
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
Pesquisador responsável:Paulo Eduardo Martins Ribolla
Beneficiário:Isabela Gaseta Ferraz Paiva
Supervisor no Exterior: Aebischer Anton (Toni)
Instituição-sede: Instituto de Biotecnologia (IBTEC). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
Local de pesquisa : Robert Koch Institute (RKI), Alemanha  
Vinculado à bolsa:17/25854-3 - Avaliação da variante alélica (L162V) do gene PPARalfa humano no estabelecimento da infecção por Leishmania infantum : utilização da tecnologia CRISPR-Cas9 para o knock-in em células da linhagem THP-1, BP.MS
Assunto(s):Leishmaniose visceral   Macrófagos   Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas

Resumo

O Receptor Ativado de Proliferação de Peroxissomos alfa (PPAR±) mostrou ser um possível gene candidato para contribuir com o risco geneticamente determinado de Leishmaniose Visceral (LV). Em um estudo caso-controle conduzido por nosso grupo na área endêmica de LV em Teresina-PI-Brasil, genótipos contendo o alelo 162V mutado foram significativamente mais freqüentes entre os indivíduos com LV do que entre todos os indivíduos não infectados.A relação de Leishmania infantum com níveis séricos de lipídios e modulação lipídica pelo PPAR± sugere que ensaios biológicos com variantes alélicas desses receptores em macrófagos infectados por L. infantum podem representar um bom caminho para a compreensão da interação parasita-hospedeiro na LV. Além disso, novas técnicas de manipulação genética, como CRISPR-Cas9, associadas a linhagens celulares estáveis com alta capacidade proliferativa, permitem a introdução de alelos de interesse (no caso do gene PPAR±, o alelo 162V) e posterior triagem com o uso de marcadores selecionáveis na aplicação em estudos funcionais para a avaliação de genes alvo de células hospedeiras (macrófagos) na infecção por L. infantum. Apesar do sistema de edição de genoma CRISPR-Cas9 ser bastante promissor, vários desafios ainda precisam ser enfrentados antes que suas aplicações sejam bem sucedidas em pacientes humanos. O maior desafio é a entrega segura e eficiente do sistema para as células alvo. Neste projeto propomos testar diferentes métodos de entrega, com foco na eletroporação versus lipofecção.