Efeito de GSK343, um inibidor da Histona Metiltransferase EZH2, sobre o parasita Schistosoma mansoni

• Processo: 18/23466-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 11 de março de 2019
• Data de Término da vigência: 10 de março de 2020
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Sergio Verjovski Almeida
• Beneficiário: Adriana Silva Andrade Pereira
• Supervisor: Conor Caffrey
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: University of California, San Diego (UC San Diego), Estados Unidos
• Vinculado à bolsa: 16/10046-6 - Efeito de GSK343, um inibidor da histona metiltransferase EZH2, sobre o parasita Schistosoma mansoni, BP.PD
• Assunto(s): Análise de sequência de RNA Schistosoma mansoni Parasitologia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Gsk343 | RNA-seq | Schistosoma mansoni | Parasitologia

Resumo

A esquistossomose é uma doença crônica e debilitante causada por um trematódeo do gênero Schistosoma e é uma das doenças mais prevalentes das regiões tropicais e subtropicais, afetando mais de 190 milhões de pessoas em 78 países. O tratamento atual da esquistossomose é baseado no uso de praziquantel (PZQ), que é eficaz contra todas as espécies de Schistosoma que infectam humanos. A possibilidade de surgimento de parasitas resistentes ao PZQ e a falta de outras drogas eficazes exigem a descoberta de novos agentes esquistossomicidas. Meus dados preliminares para a presente proposta (agora publicada) investigaram o efeito da inibição da EZH2, uma histona metiltransferase que está envolvida nos processos de remodelamento da cromatina e desta forma, controlando da expressão gênica. Especificamente, diferentes formas evolutivas (esquistossômulos e vermes adultos machos e fêmeas) do Schistosoma mansoni foram incubadas in vitro com diferentes concentrações de um inibidor seletivo da EZH2 de humanos, o composto GSK343. Para a preparação dos extratos nucleares, foram utilizados 50 pares de vermes adultos ou aproximadamente 10.000 esquistossômulos. De cada amostra, foram feitos geis de poliacrilamida-SDS (15 %) com 10 ¼g de proteínas extraídas do extrato nuclear que foram posteriormente transferidas a uma membrana de nitrocelulose seguidas da revelação de marcas de metilação e acetilação de histonas. As técnicas de RNA-seq e proteômica foram aplicadas para identificar as vias metabólicas afetadas pelo GSK343. O western blotting mostrou uma diminuição da marca de histona H3K27me3 em vermes adultos e esquistossômulos tratados com GSK343. Além disso, a motilidade dos vermes adultos apresentou-se diminuída além de uma redução de 40 % na postura de ovos em comparação com os controles (0,1 % de DMSO). Os vermes adultos tratados com GSK343 mostraram expressão significativamente alterada de genes relacionados ao transporte transmembranar, homeostase celular e ovogênese. Nas fêmeas, os genes relacionados à replicação do DNA e processos de metabolismo de RNA não codificantes apresentaram-se diminuidos. A análise de RNA-Seq de esquistossômulos tratados com inibidor de EZH2 apontou para a expressão alterada de genes relacionados à adesão celular, constituintes de membranas, transporte transmembrana, à ligação de drogas e ao canal ginecóforo. Nossos resultados indicaram que GSK343 apresenta atividades in vitro contra S. mansoni, e a caracterização da EZH2 como um potencial alvo molecular estabelece inibidores de EZH2 como parte de um novo grupo promissor de compostos que poderiam ser usados para o desenvolvimento de agentes esquistossomicidas.Com base nos dados acima, e como parte de um período de Estágios de Pesquisa no Exterior, proponho agora testar a hipótese de que o GSK343 perturba o equilíbrio entre importantes marcas histonas de ativação e inibição da transcrição. Para responder a estas questões, utilizarei ChIP-Seq com anticorpos anti-H3K27me3, anti-H3K27ac e anti-H3K4me3, em vermes adultos tratados com GSK343. Também será feito o silenciamento da SmEZH2 (Smp_078900), acompanhado da medição da oviposição em fêmeas tratadas assim como a medição com RT-qPCR do nível de expressão dos genes das vias de replicação do DNA e do metabolismo dos ncRNAs. Aqui discutimos os resultados disponíveis e explicamos quais experimentos serão realizados, justificando também por que tais experimentos devem ser realizados no laboratório do Prof. Conor R. Caffrey, da Universidade da Califórnia em San Diego, CA, EUA.