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Produção de uma cistatina de cana-de-açúcar em Nicotiana benthamiana

Processo: 18/20051-2
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
Vigência (Início): 11 de março de 2019
Vigência (Término): 10 de setembro de 2019
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Biologia Geral
Pesquisador responsável:Flavio Henrique da Silva
Beneficiário:Priscila Yumi Tanaka Shibao
Supervisor no Exterior: Andreas Schiermeyer
Instituição-sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
Local de pesquisa : Fraunhofer-Gesellschaft, Alemanha  
Vinculado à bolsa:17/16118-1 - Produção de de canacistatina em vacúolos de cana-de-açúcar transgênica, BP.DR
Assunto(s):Biotecnologia

Resumo

Fitocistatinas são inibidores de cisteíno peptidases do tipo tight binding produzidos por plantas. Além de apresentarem motivos conservados presentes em todas as cistatinas, as fitocistatinas apresentam a sequência N-terminal L-A-R-F-A-V-X (3)-N enovelada em forma de ±-hélice. Até o presente momento, o Laboratório de Biologia Molecular descobriu, produziu heterologamente e caracterizou 6 fitocistatinas de cana-de-açúcar nomeadas CaneCPI-1 a CaneCPI-6. Destas, a CaneCPI-5 já se mostrou eficiente na proteção contra erosão do esmalte do dente e atualmente está em fase de licenciamento de patente para tal uso. No entanto, a quantidade de proteína obtida tanto por meio de expressão em Escherichia coli quanto Pichia pastoris ainda é baixo para uso industrial. Assim, a produção de proteínas em plantas é o sistema mais adequado para o escalonamento desta proteína. A transformação transiente em Nicotiana benthamiana é um método rápido de produção de proteínas recombinantes através da introdução de agrobactérias geneticamente modificadas em folhas. A proteína de interesse é obtida após apenas alguns dias, extraída e purificada do tecido infiltrado. Portanto, o presente projeto tem como objetivo produzir CaneCPI-5 em Nicotiana benthamiana por transformação transiente e, paralelamente, a transformação de suspensão de células BY-2 como segunda opção para produção da proteína. Após confirmação da produção da proteína, CaneCPI-5 será purificada usando coluna de bioafinidade com níquel e a sua atividade será medida por ensaios fluorimétricos medindo a clivagem do substrato Z-Phe-Arg-AMC na presença da papaína (cisteíno peptidase). Finalizando, este projeto emprega os métodos mais avançados de molecular farming para produção de uma proteína com alto valor comercial.