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Bases moleculares da toxicidade de oligômeros proteicos associados à amiloidoses do sistema nervoso

Processo: 18/24411-3
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
Vigência (Início): 01 de janeiro de 2019
Vigência (Término): 31 de julho de 2019
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
Pesquisador responsável:Adriano Silva Sebollela
Beneficiário:Andressa Barban do Patrocinio
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:14/25681-3 - Bases moleculares da toxicidade de oligômeros protéicos associados a amiloidoses do sistema nervoso, AP.JP
Assunto(s):Proteínas   Oligômero   Amiloidose   Toxicidade   Escherichia coli

Resumo

A candidata dará continuidade às atividades desenvolvidas pelo último bolsista TT-3. Essas atividades, como previsto no Plano de Trabalho originalmente submetido à Fapesp no projeto JP, incluem a expressão e purificação dos anticorpos tipo scFv's contra oligômeros de A² em bactérias. As cepas de E. coli a serem usadas já estão disponíveis. A expressão seguirá os protocolos descritos em Sebollela et al. (2017). No formato livre de fago, a cultura será incubada a 37°C sob agitação até atingir a DO600 de 0,9, quando a expressão será induzida com IPTG. No dia seguinte, a cultura é centrifugada e o sobrenadante usado na purificação em coluna de afinidade (proteína A ou Ni, scFv expresso em fusão com cauda de histidina). Para produção de scFv's anti- A²Os ligados a fago, parte-se de uma cultura saturada de E.coli TG1 previamente transformada com vetor contendo gene para scFv anti-A²Os. Após co-infecção com helper phage KM13 e seleção com canamicina, a cultura é centrifugada e o sobrenadante contendo fagos expressando scFv na superfície é purificado por precipitação com PEG/NaCl.