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Investigação do papel da proteína Ros3 na suscetibilidade diferencial de Leishmania à miltefosina utilizando uma abordagem de CRISPR/Cas9

Processo: 18/25299-2
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado Direto
Vigência (Início): 25 de fevereiro de 2019
Vigência (Término): 24 de agosto de 2019
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
Pesquisador responsável:Silvia Reni Bortolin Uliana
Beneficiário:Caroline Ricce Espada
Supervisor no Exterior: Eva Gluenz
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Local de pesquisa : University of Oxford, Inglaterra  
Vinculado à bolsa:16/23405-4 - Suscetibilidade à miltefosina em isolados clínicos de Leishmania (Viannia) braziliensis: caracterização fenotípica e investigação das bases envolvidas na redução de suscetibilidade ao fármaco, BP.DD
Assunto(s):Leishmania   Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas   Proteína 9 associada à CRISPR

Resumo

O fármaco de primeira escolha no tratamento da leishmaniose tegumentar no Brasil, onde Leishmania (Viannia) braziliensis é o agente etiológico mais prevalente, é o antimoniato de meglumina, administrado por via endovenosa por 20 dias. As taxas de sucesso da terapia com esse fármaco podem ser tão baixas quanto 50% em algumas áreas. Temos trabalhado na avaliação da atividade de miltefosina contra isolados clínicos brasileiros de L. (V.) braziliensis, e nossos resultados mostram que esses isolados apresentam suscetibilidade variável à miltefosina. Este foi um achado intrigante, uma vez que esses isolados nunca foram expostos a este fármaco, que ainda não é aprovado para uso no Brasil. Deste modo, com o objetivo de descobrir quais são as bases moleculares envolvidas nesta diferença de suscetibilidade intrínseca, caracterizamos alguns dos mecanismos de resistência à miltefosina mais conhecidos em Leishmania. A absorção da droga mostrou-se diferente entre estes isolados, sendo reduzida em parasitas tolerantes quando comparados com isolados sensíveis e a cepa referência. Polimorfismos na maquinaria de transporte de miltefosina e diferenças nas taxas de efluxo/metabolismo, fitness e compartimentalização de fármacos não apresentaram um padrão que pudesse ser correlacionado à diferença de susceptibilidade ao fármaco nestes isolados. A análise do transcriptoma destes isolados levantou a hipótese de que as diferenças na susceptibilidade e absorção de miltefosina poderiam ser causadas pela expressão diferencial de Ros3 (componente da maquinaria de transporte de miltefosina ). Assim, o objetivo deste projeto é investigar o papel da proteína Ros3 na suscetibilidade de Leishmania à miltefosina. Pretendemos utilizar a técnica de edição gênica por CRISPR/Cas9 para produzir mutantes com a proteína Ros3 marcada e mutantes que não mais expressem essa proteína. A abordagem inicial incluirá a obtenção desses mutantes em Leishmania major, que está disponível no laboratório de destinom na Universidade de Oxford. O conhecimento em edição do genoma mediada por CRISPR/Cas9 adquirida durante este projeto será de grande importância para investigar o papel de Ros3 na suscetibilidade à miltefosina nestes isolados e também para validar funcionalmente outros genes encontrados diferencialmente expressos nesses isolados clínicos com diferentes susceptibilidades a esse fármaco.