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Efeito do desacoplamento mitocondrial e da estimulação da via glicolítica nos níveis de ATP dos espermatozóides criopreservados de ovinos

Processo: 18/18948-4
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de dezembro de 2018
Vigência (Término): 30 de novembro de 2019
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Pesquisador responsável:Marcilio Nichi
Beneficiário:Alvaro de Miranda Alves
Instituição-sede: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Sêmen   Mitocôndrias   Andrologia   Criopreservação

Resumo

A criopreservação espermática é considerada um processo chave para a utilização das biotecnologias reprodutivas em ovinos, tais como a inseminação artificial, a transferência de embriões e a fertilização in vitro. No entanto, sabe-se que esta biotécnica causa diminuição na qualidade espermática. Dentre os fatores envolvidos (e.g., formação de cristais de gelo intracelulares, aumento da osmolaridade extracelular) um mecanismo envolvido, direta ou indiretamente, nos danos durante a criopreservação, seria o estresse oxidativo. Uma vez que a mitocôndria representa a principal fonte liberadora de agente pró-oxidantes, acredita-se que esta organela possui um papel central em possíveis desequilíbrios oxidativos do espermatozoide. Portanto, disfunções mitocondriais durante a criopreservação espermática, especialmente relacionadas à danos intracelulares em organelas, são, possivelmente, a origem da liberação excessiva de espécies reativas de oxigênio (EROs). Este quadro caracteriza estresse oxidativo, que pode ocasionar danos às diferentes estruturas espermáticas pós-descongelação. Baseando-se nestas assertivas, a utilização de um protetor mitocondrial específico durante a criopreservação poderia melhorar a qualidade espermática pós-criopreservação. Tal abordagem seria interessante uma vez que diminuiria o estresse oxidativo ao evitar a formação excessiva de EROs e não o combate aos radicais livres já formados, estratégia com resultados inconsistentes. Neste contexto, uma possível alternativa seria um leve desacoplamento mitocondrial durante o processo de criopreservação. No entanto, esta conduta pode reduzir os níveis de ATP mitocondrial, já que o potencial de membrana mitocondrial, essencial para a síntese de ATP, será reduzido, podendo prejudicar a motilidade espermática. Desta forma, uma alternativa plausível seria promover um leve desacoplamento mitocondrial concomitante à estimulação de uma via secundária de obtenção de ATP, a glicólise. Portanto, o objetivo do presente estudo será verificar os níveis de ATP dos espermatozoides ovinos submetidos ao desacoplamento mitocondrial e à estimulação da via glicolítica durante o processo de criopreservação. Serão também avaliados o status mitocondrial e oxidativo assim como a cinética espermática. Para tanto, ejaculados de 7 ovinos hígidos e sexualmente maduros serão coletados usando vagina artificial. As amostras serão diluídas a uma concentração final de 100 x 106 espermatozoides/mL com o diluidor Botubov® (Botupharma, Brasil) suplementado com concentrações crescentes do desacoplador de fosforilação oxidativa CCCP (0, 1, 10 e 20µM) e tratadas ou não com glicose (0 e 5mM), em um arranjo fatorial 4x2. As amostras serão então submetidas à criopreservação. Após a descongelação seminal, serão quantificados os níveis de ATP por meio da técnica de luminescência (ATP Determination kit A22066), o status mitocondrial através do corante 3'3 diaminobenzidina (DAB) e da sonda JC-1, o status oxidativo através da sonda Cell-Rox e do ensaio de TBARS e a cinética espermática através do Sistema Computadorizado de Análise Espermática (CASA; Hamilton-Thorne®, Ivos 12.3, USA). Os resultados serão submetidos à análise estatística levando-se em conta a análise de interação do fatorial 4x2, utilizando testes paramétricos e não paramétricos de acordo com a normalidade dos resíduos e homogeneidade das variâncias. Será considerado um p<0,05 como significante. Esperamos que, com o tratamento com o desacoplador mitocondrial associado ao estímulo da via glicolítica durante a criopreservação do sêmen, os níveis de ATP se mantenham e ocorra uma melhora na função mitocondrial, no status oxidativo e na cinética espermática pós-descongelação.