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Papel da proteína CsB na homeostase de R-loops

Processo: 18/25150-9
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 04 de março de 2019
Vigência (Término): 03 de março de 2020
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Mutagênese
Pesquisador responsável:Carlos Frederico Martins Menck
Beneficiário:Giovana da Silva Leandro
Supervisor no Exterior: Andres Aguilera
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Local de pesquisa : Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), Espanha  
Vinculado à bolsa:17/14833-5 - Papel do reparo por excisão de nucleotídeos no acúmulo de R-loops e na instabilidade de telômeros em células humanas, BP.PD
Assunto(s):Reparo do DNA   Síndrome de Cockayne

Resumo

R-loops são estruturas não convencionais que ocorrem na molécula de DNA e são formadas durante o processo de transcrição quando uma molécula de RNA nascente se anela ao DNA molde. Forma-se assim uma estrutura híbrida, deixando uma fita simples de DNA. Essas estruturas ocorrem normalmente em todos os organismos, mas a perda de homeostase de sua formação e resolução acarreta no acúmulo desses híbridos e pode resultar em instabilidade genômica. Há um série de proteínas envolvidas na prevenção do acúmulo de R-loops durante o processo de transcrição, assim como proteínas envolvidas em remover essas estruturas do genoma. Estudos recentes sugerem que proteínas envolvidas na sub-via de reparo por excisão de nucleotídeos acoplado à transcrição (TC-NER) exercem papel na resolução de R-loops, apesar de que os mecanismos envolvidos nesse processo ainda não estão esclarecidos. Além disso, tem sido mostrado a associação entre algumas doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica, e o acúmulo de R-loops. Assim, este projeto tem como objetivo entender se a proteína CSB, envolvida em TC-NER, e cuja mutação resulta em uma doença neurodegenerativa denominada síndrome de Cockayne (CS), tem papel na homeostase dos R-loops. Considerando que foi demonstrado o papel da proteína CSB no remodelamento de histonas e que também foi mostrado que o dano no DNA mediado por R-loops depende de modificações em histonas, pretendemos também verificar o papel de CSB no remodelamento de histonas em um contexto de desregulação na homeostase dos R-loops. Assim, para atingirmos esses objetivos, serão realizadas técnicas de imunoprecipitação de DNA-RNA (DRIP) para verificar a quantidade de R-loops em células com mutações em CSB, e será também realizado o sequenciamento de nova geração das regiões imunoprecipitadas (DRIP-seq) para identificar hot-spots para o acúmulo desses híbridos em CS. Serão desenvolvidos modelos biológicos usando proteínas marcadas com fluorescência, os quais permitirão a identificação do recrutamento de proteínas para os R-loops em tempo real por meio de microscopia confocal depois da indução de danos no DNA por radiação ultravioleta. Outras técnicas de imunocitoquímica serão realizadas as quais nos permitirão avaliar a co-localização de proteínas específicas com os híbridos de DNA-RNA, assim como com lesões no DNA. Além disso, iremos utilizar modelos celulares com mutações nas histonas H3 e H4 para avaliar se a perda da função de CSB associada a modificação de histonas pode interferir na indução de danos no DNA mediada por R-loops. Dessa forma, os resultados obtidos poderão contribuir para o entendimento da neuropatologia de CS, assim como dos mecanismos envolvidos no processamento e acúmulo de R-loops nas células eucarióticas.