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Termo-estabilidade de antivenenos: avaliação da formação de agregados proteicos

Processo: 18/25163-3
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de fevereiro de 2019
Vigência (Término): 30 de abril de 2020
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Imunologia - Imunoquímica
Pesquisador responsável:Carla Cristina Squaiella
Beneficiário:Maria Carolina Clares Ramalho
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Imunização passiva   Antivenenos   Estabilidade térmica   Agregados proteicos   Sistema do complemento

Resumo

Devido ao seu alto impacto, o envenenamento por animais peçonhentos tem sido considerado uma doença tropical negligenciada pela Organização Mundial da Saúde (OMS), e os antivenenos estão incluídos na Lista de Medicamentos Essenciais da OMS, tornando a soroterapia o pilar para a melhoria dos pacientes. A soroterapia consiste na transferência de imunoglobulinas de um indivíduo imunizado para outro não imunizado, a fim de conferir proteção rápida contra determinado antígeno. No Brasil, são utilizados antivenenos de origem heteróloga contendo fragmentos F(ab')2, já que, de acordo com dados da literatura, IgGs íntegras e a porção Fc são comprovadamente capazes de induzir a geração de anafilatoxinas (C3a, C4a, C5a). Em trabalhos anteriores, nosso grupo demonstrou que muitos antivenenos possuem, no produto envasado, agregados proteicos e moléculas de IgG íntegras, que resistiram aos métodos de purificação, além de contaminantes que não são direcionados para antígenos do veneno e que não participam de seu efeito terapêutico. Todos esses fatores podem contribuir para o surgimento de reações adversas em pacientes submetidos à soroterapia. Tais reações têm sido atribuídas à ativação do complemento, principalmente pela presença de agregados. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, foi sugerida a utilização de métodos de ativação do complemento como parâmetros para confirmar a presença de agregados proteicos nos antivenenos e definir níveis aceitáveis desses agregados. Não se pode descartar a possibilidade de formação de agregados proteicos ao longo do armazenamento dos antivenenos envasados, ou dos plasmas hiperimunes que constituem a matéria-prima para a produção de antivenenos, mesmo que estejam dentro dos prazos de validade e em temperatura adequada. As condições de infraestrutura quanto ao transporte e armazenamento também devem ser consideradas, a fim de determinar o efeito do tempo e da temperatura em relação à geração destes agregados. O presente projeto tem como objetivo estudar o impacto do tempo e temperatura de armazenamento dos plasmas hiperimunes e dos antivenenos envasados sobre a formação de agregados proteicos, o que poderia aumentar a incidência de reações de hipersensibilidade. Amostras de antivenenos envasados foram obtidas anteriormente e incubadas por 30, 60 e 90 dias nas temperaturas de 25°C e 37°C. Após os períodos de incubação, as amostras foram congeladas a -20°C pelo período de 48 meses. Amostras dos mesmos lotes foram mantidas a 4°C por todo o período, para fins de comparação. Amostras de plasmas hiperimunes também foram obtidas e serão incubadas a 37°C por 30, 60 e 90 dias, comparando-se às mesmas amostras mantidas a 4°C. Todas as amostras serão avaliadas quanto à concentração proteica, ao perfil eletroforético e reação de Western Blot para detecção de IgG, permitindo a visualização de possíveis agregados proteicos, bem como imunoglobulinas íntegras, proteínas contaminantes ou produtos de degradação. Além disso, a ativação do sistema complemento pelas amostras será avaliada pela geração de anafilatoxinas in vitro, incubando-se as amostras com soro humano normal, e analisando a geração de C3a, C4a e C5a por citometria de fluxo. Os resultados permitirão determinar o impacto do tempo e temperatura sobre a formação de agregados em antivenenos, contribuindo para o desenvolvimento de antivenenos de melhor qualidade, e também para a possível incorporação de novos métodos de controle de qualidade de antivenenos.