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Obtenção de mutantes de Leptospira biflexa e Leptospira interrogans para a avaliação do papel funcional de proteínas do tipo HtrA presentes nas estirpes patogênicas

Processo: 18/21959-8
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
Vigência (Início): 01 de março de 2019
Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2021
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Ana Lucia Tabet Oller Do Nascimento
Beneficiário:Brenda Daroz
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:14/50981-0 - Busca de proteínas de superfície nas sequências do genoma da Leptospira interrogans: caracterização funcional e imunológica para o entendimento de mecanismos envolvidos na patogênese de bactéria, AP.TEM
Assunto(s):Biologia molecular   Etiologia   Leptospira   Vacinas   Camundongos mutantes   Imunofluorescência

Resumo

As leptospiras são divididas em espécies saprófitas, de vida livre, como a L. biflexa, e as patogêncicas, como a L. interrogans, causadoras da Leptospirose. Esta doença é uma zoonose de importância global recentemente incluída na lista das Doenças Tropicais Negligenciadas. Os roedores desempenham o papel de principais reservatórios da doença em centros urbanos por permitirem a colonização das leptospiras nos túbulos renais proximais e as excretarem vivas na urina. Não há vacina eficaz até o momento. A identificação de proteínas da membrana externa conservadas entre cepas patogênicas são os principais alvos de pesquisa para elucidar os mecanismos de patogenicidade. São estas proteínas que, provavelmente, estão envolvidas na interação das leptospiras com o ambiente externo, podendo também servir de alvo para o sistema imune do hospedeiro. Ademais, algumas espiroquetas se utilizam de proteases de membrana externa como um mecanismo de disseminação por tecidos do hospedeiro. Neste sentido, o projeto propõe a criação de Leptospira mutantes para os genes LIC11111, LIC1112, LIC20143 e LIC11037 super expressando-os, no caso de L. biflexa (saprofítica) ou silenciando-os, no caso da L. interrogans (patogênica). Estas proteínas são do tipo HtrA (High temperature requirement A), pertencentes a uma importante família de proteases, identificadas por bioinformática no genoma de L. interrogans. Pretende-se caracterizar estas proteínas in vitro quanto a reatividade frente a componentes do hospedeiro e avaliar a atividade enzimática através da degradação de componentes da matriz extracelular, como a fibronectina. Para validar a função e importância destas proteínas, o projeto propõe obter leptospiras mutantes, knock-in, no caso de saprófitas e knock-out, no caso de patogênicas. A ideia é avaliar a aquisição ou perda de função destes mutantes em comparação com as observadas in vitro. Os mutantes serão usados para avaliar (a) localização celular das proteínas utilizando a técnica de imunofluorescência, no caso de knock-in; (b) reatividade das bactérias recombinantes frente a soros de pacientes diagnosticados com Leptospirose- comparando knock-in e knock-out e; (c) interação das bactérias expressando as proteínas com macromoléculas do hospedeiro e seu potencial proteolítico sobre as mesmas (ambos os mutantes knock-in e knock-out). (AU)