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Produção de L-asparaginase por Pichia Pastoris em cultivos descontínuos-alimentados em biorreatores

Processo: 19/02657-3
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado Direto
Vigência (Início): 02 de junho de 2019
Vigência (Término): 01 de dezembro de 2019
Área do conhecimento:Engenharias - Engenharia Química
Pesquisador responsável:Aldo Tonso
Beneficiário:Letícia de Almeida Parizotto
Supervisor no Exterior: Ursula Rinas
Instituição-sede: Escola Politécnica (EP). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Local de pesquisa : Leibniz Universität Hannover, Alemanha  
Vinculado à bolsa:17/25065-9 - Produção de L-asparaginase por Pichia pastoris em cultivos descontínuos-alimentados em biorreatores, BP.DD
Assunto(s):Reatores biológicos   Bioprocessos   Pichia pastoris   L-asparaginase

Resumo

Este doutorado faz parte de um projeto temático (processo Fapesp 13 / 08617-7) que visa o desenvolvimento de formas inovadoras de L-asparaginase (ASNase). Esta enzima é aplicada no tratamento da Leucemia Linfoblástica Aguda e, atualmente, não é produzida no Brasil. Entre as formas inovadoras, esta pesquisa estuda a produção da ASNase da bactéria Erwinia chrysanthemi (Dickeya chrysanthemi) expressa em uma cepa glicoengenheirada da levedura Pichia pastoris (Komagataella phaffi) em biorreator. Esta cepa, chamada Glycoswitch®, realiza glicosilação mais similar às células humanas, produzindo proteína recombinante humanizada mais adequada para propósitos clínicos. Atualmente, o processo está sendo realizado de maneira simples em um biorreator com a fase de indução baseada em pulsos de metanol, resultando em produção de ASNase abaixo de 2000U / L, o que é menor do que o relatado na literatura. A expressão heteróloga em Pichia é significativamente influenciada pela estratégia de alimentação de metanol e a estratégia mais recomendada é manter a concentração de metanol entre 2,0 g / L e 3,5 g / L. O principal objetivo deste estágio é estudar diferentes concentrações de metanol em bateladas alimentadas em biorreator com estratégia de alimentação controlada com um sensor de metanol on-line em circuito fechado. Além disso, observou-se que a produção de ASNase diminui durante a fase de indução e a causa está sendo investigada. Uma hipótese é a resposta a proteínas mal enoveladas (UPR - unfolded protein response) relatada em Pichia. Em caso de degradação durante as diferentes estratégias de indução, uma análise proteômica pode esclarecer se as enzimas da via UPR estão sendo produzidas e resultando em menor produção. Os dados desses experimentos irão fornecer uma grande compreensão sobre o processo, possivelmente levando a uma expressão mais alta de ASNase.

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