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Avaliação in vitro da capacidade neutralizante de fragmentos Fab recombinantes contra as toxinas Shiga em linhagens celulares renais humanas

Processo: 18/24659-5
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de abril de 2019
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2019
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Saúde Coletiva - Saúde Pública
Pesquisador responsável:Daniela Luz Hessel da Cunha
Beneficiário:Raissa Lozzardo Ferreira
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil

Resumo

As toxinas de Shiga (Stx1 e Stx2) produzidas por Escherichia coli produtora da toxina de Shiga (STEC), são potentes citotoxinas do tipo AB5. Este tipo de toxina é caracterizada por uma estrutura formada por dois domínios funcionais característicos: a subunidade B forma um pentâmero responsável pela ligação da toxina ao seu receptor, GB3 e a subunidade A possui ação catalítica, que atua como uma N-RNA glicosidase, retirando uma adenina da porção 28S do ribossomo, o que interrompe a síntese proteica e leva a célula a morte por apoptose. Os rins são os órgãos mais afetados pelo efeito tóxico das Stx, principalmente por expressarem em grande quantidade desse receptor. A consequência mais grave dessa intoxicação é o desenvolvimento de síndrome hemolítica urêmica (SHU), que afeta de 5 a 15% dos pacientes infectados por STEC e pode levar 10% desses pacientes a óbito, sendo um importante problema de saúde pública e segurança alimentar. As terapias existentes não são efetivas contra essa complicação, sendo a neutralização de Stx o tratamento mais indicado. A alta especificidade e afinidade dos anticorpos têm feito dessas moléculas, ferramentas utilizadas na terapia de diversas doenças, além disso, a partir da tecnologia do DNA recombinante, é possível o desenvolvimento de fragmentos de anticorpos como ferramentas terapêuticas. Empregando tal tecnologia, por Phage Display, a partir de uma biblioteca de fagos sintética, foram obtidos em trabalhos anteriores, quatro fragmentos Fab de anticorpos recombinantes humanos (dois contra cada toxina Stx), sendo estes expressos de maneira heteróloga em bactérias, livres de LPS. Estes diferentes Fab foram previamente caracterizados e se mostraram eficientes no seu reconhecimento ao antígeno, possuindo alta afinidade contra as toxinas alvo e capacidade de neutralizar o efeito citotóxico in vitro em ensaios em células Vero (teste padrão ouro para estas toxinas) utilizando a toxina purificada, fazendo com que esses fragmentos de anticorpos fossem considerados possíveis ferramentas promissoras para a neutralização de Stx e prevenção de SHU. Neste contexto, o presente trabalho propõe aprofundar a caracterização da capacidade neutralizante destas moléculas de anticorpo em linhagens celulares renais humanas, sendo uma epitelial e outra de túbulo proximal (HEK e HK-2, respectivamente), utilizando tanto a toxina purificada quanto toxinas produzidas por cepas de STEC de origem humana e de casos de SHU, com a proposta de validá-las antes de avançarmos para testes em modelo animal, com a finalidade de comprovar a habilidade dessas moléculas em neutralizar o efeito tóxico e prevenir as sequelas resultante da ação das toxinas de Shiga.