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Padronização da técnica Sherlock (specific high sensitivity Enzamatic repórter Unlocking) utilizando a proteína Cas13a para diagnóstico do vírus respiratório sincicial em pacientes pediátricos

Processo: 18/23680-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de abril de 2019
Vigência (Término): 30 de novembro de 2020
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
Pesquisador responsável:Edison Luiz Durigon
Beneficiário:Camila Pereira Soares
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Crianças   Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas   Técnicas de diagnóstico molecular   Biologia molecular

Resumo

O VRS é um vírus amplamente distribuído no mundo e é o principal vírus envolvido em infecções respiratórias do trato inferior. A população de risco dessas infecções são crianças menores de 5 anos, pacientes imunocomprometidos e idosos. O VRS pertence à família Pneumoviridae, seu genoma é composto por uma molécula de RNA fita simples e codifica 11 proteínas. Dividido em 2 grupos antigênicos com base na genotipagem da proteína G (A e B), possui diversos genótipos bem caracterizados dentro de cada grupo. A similaridade entre os sintomas causados pela infecção do VRS com outros vírus respiratórios inviabiliza o diagnóstico clínico preciso. Nesse contexto, os métodos de diagnósticos laboratoriais se apresentam extremamente importantes. Primeiramente, porque impedem a prática comum de prescrição de antibióticos e porque medidas de isolamento de pacientes podem ser aplicadas diminuindo o grau de disseminação viral. Algumas novidades têm surgido nos últimos anos no que se refere à diagnóstico molecular, no entanto, uma têm se apresentado de forma bastante promissora: a técnica de edição gênica CRISPR-Cas. A técnica que utiliza a endonuclease de origem bacteriana Cas9 para editar sequencias de DNA já tem seu estudo bastante difundido, e agora novas proteínas começaram a competir pelos holofotes. Dois artigos publicados no início de 2018 mostraram o sucesso de duas técnicas que utilizaram proteínas como a Cas13 e a Cas12 no diagnóstico de vírus como Zika e HPV. A técnica SHERLOCK (Specific High-Sensitivity Enzimatic Reporter Unlocking) conseguiu detector com alta sensibilidade e especificidade o RNA viral de amostras em poucos minutos utilizando a proteína Cas13a. Uma característica dessa técnica que a torna simples e rápida é a utilização da técnica RPA (Reaction Polymerase Amplification) como método de amplificação do material genético que, diferentemente do PCR é isotermal, e dispensa o uso de aparelhos termociladores. Nosso objetivo nesse trabalho é padronizar a técnica SHERLOCK, utilizando a proteína Cas13a de Leptrotricia wadeii para detectar o Vírus Respiratório Sincicial Humano em amostras de crianças com doença respiratória aguda e comparar com a técnica padrão de Real Time PCR.