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Padronização da técnica Sherlock (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking) utilizando a proteína Cas13a para diagnóstico do vírus respiratório sincicial em pacientes pediátricos

Processo: 18/23680-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de abril de 2019
Vigência (Término): 30 de novembro de 2020
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
Pesquisador responsável:Edison Luiz Durigon
Beneficiário:Camila Pereira Soares
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Crianças   Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas   Técnicas de diagnóstico molecular   Biologia molecular

Resumo

O VRS é um vírus amplamente distribuído no mundo e é o principal vírus envolvido em infecções respiratórias do trato inferior. A população de risco dessas infecções são crianças menores de 5 anos, pacientes imunocomprometidos e idosos. O VRS pertence à família Pneumoviridae, seu genoma é composto por uma molécula de RNA fita simples e codifica 11 proteínas. Dividido em 2 grupos antigênicos com base na genotipagem da proteína G (A e B), possui diversos genótipos bem caracterizados dentro de cada grupo. A similaridade entre os sintomas causados pela infecção do VRS com outros vírus respiratórios inviabiliza o diagnóstico clínico preciso. Nesse contexto, os métodos de diagnósticos laboratoriais se apresentam extremamente importantes. Primeiramente, porque impedem a prática comum de prescrição de antibióticos e porque medidas de isolamento de pacientes podem ser aplicadas diminuindo o grau de disseminação viral. Algumas novidades têm surgido nos últimos anos no que se refere à diagnóstico molecular, no entanto, uma têm se apresentado de forma bastante promissora: a técnica de edição gênica CRISPR-Cas. A técnica que utiliza a endonuclease de origem bacteriana Cas9 para editar sequencias de DNA já tem seu estudo bastante difundido, e agora novas proteínas começaram a competir pelos holofotes. Dois artigos publicados no início de 2018 mostraram o sucesso de duas técnicas que utilizaram proteínas como a Cas13 e a Cas12 no diagnóstico de vírus como Zika e HPV. A técnica SHERLOCK (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking) conseguiu detector com alta sensibilidade e especificidade o RNA viral de amostras em poucos minutos utilizando a proteína Cas13a. Uma característica dessa técnica que a torna simples e rápida é a utilização da técnica RPA (Reaction Polymerase Amplification) como método de amplificação do material genético que, diferentemente do PCR é isotermal, e dispensa o uso de aparelhos termociladores. Nosso objetivo nesse trabalho é padronizar a técnica SHERLOCK, utilizando a proteína Cas13a de Leptrotricia wadeii para detectar o Vírus Respiratório Sincicial Humano em amostras de crianças com doença respiratória aguda e comparar com a técnica padrão de Real Time PCR.

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Publicações científicas (6)
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
DE FREITAS DUTRA, VALERIA; BONET-BUB, CAROLINA; YOKOYAMA, ANA PAULA H.; ACHKAR, RUTH; MACHADO, RAFAEL RAHAL GUARAGNA; ASSUNCAO, MURILO; CANDELARIA, GABRIELA; SOARES, CAMILA PEREIRA; FACHINI, ROBERTA MARIA; FONTAO-WENDEL, RITA; HAMERSCHLAK, NELSON; REIS, LUIZ FERNANDO LIMA; ARAUJO, DANIELLE BASTOS; NUDELMAN, VICTOR; PINHO, JOAO R. R.; RIZZO, LUIZ V.; SAKASHITA, ARACI M.; SCURACCHIO, PATRICIA; DURIGON, EDISON LUIZ; WENDEL, SILVANO; KUTNER, JOSE M. Anti-A and SARS-CoV-2: an intriguing association. Vox Sanguinis, v. 116, n. 5 MAR 2021. Citações Web of Science: 1.
BATISTA DOS SANTOS, JULIANA DE MELO; SOARES, CAMILA PEREIRA; MONTEIRO, FERNANDA RODRIGUES; MELLO, RALYRIA; DO AMARAL, JONATAS BUSSADOR; AGUIAR, ANDRESSA SIMOES; SOLEDADE, MARIANA PEREIRA; SUCUPIRA, CAROLINA; DE PAULIS, MILENA; ANDRADE, JULIANA BANNWART; ALMEIDA, FLAVIA JAQUELINE; PALAZZI SAFADI, MARCO AURELIO; MAU, LUCIANA BECKER; BRASIL, JAMILE MENEZES; RAMALHO, THERESA; LOURES, V, FLAVIO; VIEIRA, RODOLFO PAULA; DURIGON, EDISON LUIZ; LEAL DE OLIVEIRA, DANIELLE BRUNA; LACERDA BACHI, ANDRE LUIS. In Nasal Mucosal Secretions, Distinct IFN and IgA Responses Are Found in Severe and Mild SARS-CoV-2 Infection. FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, v. 12, FEB 25 2021. Citações Web of Science: 0.
WENDEL, SILVANO; FONTAO-WENDEL, RITA; FACHINI, ROBERTA; CANDELARIA, GABRIELA; SCURACCHIO, PATRICIA; ACHKAR, RUTH; BRITO, MAYRA; REIS, LUIZ FERNANDO; CAMARGO, ANAMARIA; AMANO, MARIANE; MACHADO, RAFAEL; ARAUJO, DANIELLE; SOARES, CAMILA; DURIGON, EDISON. A longitudinal study of convalescent plasma (CCP) donors and correlation of ABO group, initial neutralizing antibodies (nAb), and body mass index (BMI) with nAb and anti-nucleocapsid (NP) SARS-CoV-2 antibody kinetics: Proposals for better quality of CCP collections. Transfusion, v. 61, n. 5 FEB 2021. Citações Web of Science: 4.
WENDEL, SILVANO; KUTNER, JOSE MAURO; MACHADO, RAFAEL; FONTAO-WENDEL, RITA; BUB, CAROLINA; FACHINI, ROBERTA; YOKOYAMA, ANA; CANDELARIA, GABRIELA; SAKASHITA, ARACI; ACHKAR, RUTH; HAMERSCHLAK, NELSON; SCURACCHIO, PATRICIA; AMARAL, MARCELO; DAL BEN, MIRIAN; ARAUJO, DANIELLE; SOARES, CAMILA; CAMARGO, ANAMARIA; KALLAS, ESPER; DURIGON, EDISON; REIS, LUIZ FERNANDO; RIZZO, LUIZ VICENTE. Screening forSARS-CoV-2 antibodies in convalescent plasma in Brazil: Preliminary lessons from a voluntary convalescent donor program. Transfusion, v. 60, n. 12, p. 2938-2951, DEC 2020. Citações Web of Science: 1.
DORLASS, ERICK GUSTAVO; MONTEIRO, CAIRO OLIVEIRA; VIANA, AMANDA OLIVEIRA; SOARES, CAMILA PEREIRA; GUARAGNA MACHADO, RAFAEL RAHAL; THOMAZELLI, LUCIANO MATSUMIYA; ARAUJO, DANIELLE BASTOS; LEAL, FABYANO BRUNO; CANDIDO, ERIKA DONIZETTE; TELEZYNSKI, BRUNA LAROTONDA; VALERIO, CAMILA ARAUJO; CHALUP, VANESSA NASCIMENTO; MELLO, RALYRIA; ALMEIDA, FLAVIA JAQUELINE; AGUIAR, ANDRESSA SIMOES; MOTT BARRIENTOS, ANNA CARLOTTA; SUCUPIRA, CAROLINA; DE PAULIS, MILENA; PALAZZI SAFADI, MARCO AURELIO; BONFIM PRADO SILVA, DANIELLA GREGORIO; MARTINS SODRE, JANAINA JOICE; SOLEDADE, MARIANA PEREIRA; MATOS, SAMANTHA FARIA; FERREIRA, SABRINA RODRIGUES; NUNEZ PINEZ, CELIA MIRANDA; BUONAFINE, CAROLINA PALAMIN; FERREIRA PIERONI, LETICIA NERY; MALTA, FERNANDA MELLO; FERRAZ SANTANA, RUBIA ANITA; SOUZA, ELOISA CORREA; FOCK, RICARDO AMBROSIO; REBELO PINHO, JOAO RENATO; SOUZA FERREIRA, LUIS CARLOS; BOTOSSO, VIVIANE FONGARO; DURIGON, EDISON LUIZ; LEAL OLIVEIRA, DANIELLE BRUNA. Lower cost alternatives for molecular diagnosis of COVID-19: conventional RT-PCR and SYBR Green-based RT-qPCR. Brazilian Journal of Microbiology, v. 51, n. 3 AUG 2020. Citações Web of Science: 0.
DANIELLE BASTOS ARAUJO; RAFAEL RAHAL GUARAGNA MACHADO; DEYVID EMANUEL AMGARTEN; FERNANDA DE MELLO MALTA; GABRIEL GUARANY DE ARAUJO; CAIRO OLIVEIRA MONTEIRO; ERIKA DONIZETTI CANDIDO; CAMILA PEREIRA SOARES; FERNANDO GATTI DE MENEZES; ANA CAROLINA CORNACHIONI PIRES; RÚBIA ANITA FERRAZ SANTANA; AMANDA DE OLIVEIRA VIANA; ERICK DORLASS; LUCIANO THOMAZELLI; LUIS CARLOS DE SOUSA FERREIRA; VIVIANE FONGARO BOTOSSO; CRISTIANE RODRIGUES GUZZO CARVALHO; DANIELLE BRUNA LEAL OLIVEIRA; JOÃO RENATO REBELLO PINHO; EDISON LUIZ DURIGON. SARS-CoV-2 isolation from the first reported patients in Brazil and establishment of a coordinated task network. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 115, p. -, 2020.

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