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Clonagem de domínios truncados da proteína Fbxl17 em vetores de expressão bacteriana

Processo: 19/03943-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de maio de 2019
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2021
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Felipe Roberti Teixeira
Beneficiário:Camila Rolemberg Santana Travaglini Berti de Correia
Instituição-sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
Assunto(s):Bioquímica celular   Neoplasias mamárias   Clonagem   Mutação   Ligantes   Substratos

Resumo

A Fbxl17 é uma das sessenta e nove proteínas do tipo F-box (Fbox) capazes de interagir, através deste domínio, com SKP1 (S-phase kinase-associated protein 1), Cullin 1 e Rbx 1 (RING-box protein 1) para formar o complexo denominado SCF (SKP1, Cullin1 e F-box protein), a maior classe de E3 ubiquitina ligases em humanos. A função canônica destes complexos é ubiquitinar seus substratos, seja para destiná-los para degradação via proteassoma ou para modulação de função. As proteínas do tipo Fbxl, além de seu domínio F-box, apresentam um domínio rico em leucina em sua região C-terminal - domínio LRR (Leucine Rich Repeat) -, que interage com seus substratos garantindo a especificidade do complexo. No projeto METABRIC (Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium) foram identificadas mutações no gene da proteína Fbxl17 que acarretam em truncamentos do domínio LRR em cento e trinta e cinco das 1992 amostras de pacientes analisadas. Além disso, através de CGH-array (Comparative Genomic Hybridization Array) em setecentas e quarenta e seis linhagens de células tumorais evidenciou-se a existência de quebras do gene da Fbxl17 que acarretou na formação de versões da Fbx17 com truncamentos em seu domínio LRR em três linhagens de câncer de mama - BT-474, HCC38 e HCC1395- e uma de câncer esofágico/gástrico -OE-19. Nosso grupo de pesquisa busca identificar e caracterizar os ligantes e substratos da Fbxl17 e seus mutantes Fbxl17-D3-LRR e Fbxl17-D10-LRR presentes em amostras de pacientes para entender como estas mutações afetam o desenvolvimento celular (Processo FAPESP 2016/25798-3). Atualmente, não há anticorpos comerciais anti-Fbxl17 de qualidade que possam ser utilizados em western blot ou imunofluorescência. Além disso, nenhum trabalho descreveu anticorpos capazes de discriminar as formas selvagem das Fbxl17 mutantes. Desta forma, este projeto visa clonar fragmentos N-terminal (1-228), F-box (210-422) e C-terminal (412-711) da proteína Fbxl17 em vetor de expressão em bactérias pET28a para posterior purificação e imunização para produção de anticorpos. Além disso, estes fragmentos também serão utilizados para ensaios de interação proteína-proteína in vitro com seus substratos e ligantes para mapeamento de regiões de interação. Desta forma, este trabalho contribuirá para o entendimento das funções celulares de Fbxl17 e seus mutantes.

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
SPAGNOL, VALENTINE; OLIVEIRA, CAIO A. B.; RANDLE, SUZANNE J.; PASSOS, PATRICIA M. S.; CORREIA, CAMILA R. S. T. B.; SIMAROLI, NATALIA B.; OLIVEIRA, JOICE S.; MEVISSEN, TYCHO E. T.; MEDEIROS, ANA CARLA; GOMES, MARCELO D.; KOMANDER, DAVID; LAMAN, HEIKE; TEIXEIRA, FELIPE ROBERTI. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-kappa B signaling pathway. BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-GENERAL SUBJECTS, v. 1865, n. 1 JAN 2021. Citações Web of Science: 0.

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