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Efeito da mutação de Ggps1 nas funções de células ósseas in vitro e na fragilidade diafisária in vivo usando camundongos após cirurgia de ovariectomia e expostos ao tratamento de longa duração com bifosfonatos contendo nitrogênio

Processo: 19/08048-9
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
Vigência (Início): 01 de outubro de 2019
Vigência (Término): 30 de setembro de 2020
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Odontologia - Cirurgia Buco-maxilo-facial
Pesquisador responsável:Adalberto Luiz Rosa
Beneficiário:Alann Thaffarell Portilho de Souza
Supervisor no Exterior: Roland Baron
Instituição-sede: Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (FORP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Local de pesquisa : Harvard University, Boston, Estados Unidos  
Vinculado à bolsa:18/13290-0 - Terapia celular: avaliação do efeito de células-tronco mesenquimais para regenerar tecido ósseo de ratos com Osteoporose, Diabetes Mellitus ou Hipertensão Arterial, BP.DR
Assunto(s):Difosfonatos   Osteoporose

Resumo

Osteoporose (OP) é uma doença metabólica óssea considerada um problema de saúde mundial. Dados da literatura têm mostrado que pacientes que tomam medicamentos antirreabsortivos, como os bisfosfonatos (BP), possuem risco aumentado de desenvolver fratura femoral atípica (AFF). A patogênese da AFF permanece desconhecida, mas estudos em pacientes com OP que sofreram AFFs têm revelado que há uma mutação na enzima geranilgeranil pirofosfato sintase (Ggps1), um componente da via do mevalonato que é alvo de bifosfonatos contendo nitrogênio (NBPs). Nossa hipótese geral é que a mutação em Ggps1 predispõe os pacientes à fragilidade diafisária espontaneamente ou quando tratados com NBPs. Neste estudo, vamos determinar in vitro se este gene mutado nos pacientes com AFF afeta as funções das células ósseas e determinar in vivo se estas alterações genéticas promovem fragilidade diafisária em camundongos após cirurgia de ovariectomia (OVX) expostas ao tratamento de longa duração com NBPs. Assim, os objetivos deste estudo são: 1) compreender o efeito do da redução da expressão de Ggps1 na diferenciação e/ou função de células ósseas e identificar quais proteínas são afetadas por geranilação alterada nessas células e 2) determinar o quanto a haploinsuficiência de Ggps1, um modelo de perda parcial da função, aumenta a fragilidade diafisária em camundongos OVX e/ou após tratamento com NBPs, em comparação com BPs que não contém nitrogênio. Para isso, serão gerados camundongos Ggps1+/- e Ggps1+/+ e a diferenciação osteoclástica (OC) será avaliada em cultura primária de macrófagos oriundos da medula óssea (BMMs) isolados de ossos longos de camundongos Ggps1+/- and Ggps1+/+. Células tratadas com fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF) e ligante do receptor ativador do fator nuclear kappa-ß (RANKL) serão avaliadas quanto à expressão de marcadores de OC; células multinucleadas positivas à fosfatase ácido resistente ao tartarato (TRAP) serão contadas e a função de reabsorção, analisada sobre discos de dentina. Considerando que a mutação está presente em todas as células dos pacientes, a diferenciação de osteoblastos (OB) e osteócitos (OCY) também será avaliada em células estromais da medula óssea (BMSCs), cultura primária de OB de calvária e OCY isolados dos ossos longos de camundongos Ggps1+/- and Ggps1+/+ através da avaliação da expressão dos marcadores de OB e OCY, bem como a atividade da fosfatase alcalina (ALP) e deposição mineral. Camundongos Ggps1+/- produzidos a partir de C57/BL6 (background) serão cruzados com camundongos wild type C57/BL6 (Ggps1+/+) para gerar uma ninhada de Ggps1+/- and Ggps1+/+, a fim de posteriormente caracterizar os efeitos da haploinsuficiência de Ggps1 na resposta esquelética ao tratamento com NBPs usando raios-X, µCT, histomorfometria, análise de marcadores séricos ósseos, expressão de genes específicos de OCY por qRT-PCR e testes biomecânicos. Os efeitos do tratamento serão avaliados usando ANOVA para todas as variáveis contínuas, com teste post-hoc de Fischer e/ou Tukey. Será utilizada ANOVA de dois fatores para determinar o quanto o efeito do tratamento depende do genótipo. As diferenças serão consideradas significativas quando p<0,05.