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Avaliação da cascata de sinalização TORC1 em células mutantes da levedura Saccharomyces cerevisiae: implicações no tempo de vida cronológico e ativação do proteassomo

Processo: 19/07429-9
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de junho de 2019
Vigência (Término): 30 de novembro de 2019
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Metabolismo e Bioenergética
Pesquisador responsável:Marilene Demasi
Beneficiário:Beatriz Marin Seixas de Carvalho
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:13/07937-8 - Redoxoma, AP.CEPID
Assunto(s):Leveduras   Saccharomyces cerevisiae   Proteólise   Proteômica

Resumo

A presente proposta está inserida dentro da linha de pesquisa desenvolvida pelo nosso grupo, referente ao papel da modulação redox do proteassomo no metabolismo proteico e, por conseguinte, na homeostase celular. O proteassomo é um complexo proteico responsável pela degradação principalmente de proteínas reguladas pelo processo de poliubiquitinação envolvidas na regulação e sinalização celular, apresentação antigênica e controle de síntese proteica. Ele consiste de uma unidade catalítica central denominada de proteassomo 20S (20SPT), onde se localizam os sítios catalíticos, e por unidades regulatórias (19S a mais abundante) acopladas em uma ou ambas as extremidades da porção central, em orientações opostas, para formar o proteassomo denominado de 26S. A unidade catalítica, o 20SPT, destituída de unidades regulatórias, também é capaz de degradar proteínas independentemente da modificação com cauda de poliubiquitina, como no caso de proteínas oxidadas, dentre outras. O 20SPT é constituído por uma unidade central formada por dois heptâmeros denominados ² flanqueados por outros dois heptâmeros denominados ±. Os sítios catalíticos se localizam nas subunidades ² sendo que as subunidades ±, regulam a abertura/fechamento da câmera catalítica. Nosso grupo descreveu a modificação redox pós-traducional denominada de S-glutationilação do 20SPT da levedura S. cerevisiae (DEMASI; SILVA; NETTO, 2003). Verificamos em estudos posteriores (SILVA et al., 2012; DEMASI et al., 2014a; DEMASI et al., 2014b) que os resíduos de cisteína do 20SPT glutationiláveis concentram-se exclusivamente nas subunidades ± do PT20S, especificamente os resíduos ±5-C76 e ±5-C221. Em projeto posterior foram realizados estudos funcionais e estruturais do 20SPT após mutação sítio-específica dos resíduos de Cys glutationiláveis, como citados acima, e avalições fenotípicas das linhagens que carregam as mutações do 20SPT. O conjunto dos resultados obtidos (LEME et al., 2019), revelaram que as consequências estruturais e funcionais dessas mutações foram o aumento da frequência da conformação fechada da câmara catalítica no ±5-C76S-PT20S e ±5-C221S-PT20S. As linhagens que carregam essas mutações apresentaram menor tempo de vida cronológico quando comparadas com a linhagem selvagem. Uma dupla mutação randômica na subunidade ±5 (S35P/C221S) induziu a abertura da câmera catalítica do 20SPT. Em relação ao fenótipo, aumento na resistência ao estresse oxidativo e tempo aumentado de tempo de vida cronológico (CLS: Chronological LifeSpan) foram identificados na linhagem S35P/C221S, onde o 20SPT é mais ativo. Outra conclusão importante em termos fenotípicos foi a de que o tempo de vida cronológico das linhagens estudadas está positivamente associado ao aumento da frequência da configuração aberta da câmera catalítica do 20SPT. Posteriormente, as duas linhagens mutantes que apresentaram CLS opostos foram utilizadas para uma análise proteômica diferencial. Os dados obtidos (SANTIAGO, 2018) revelaram que duas proteínas associadas à sinalização denominada de TOR (Target of Rapamicin) apresentam-se em concentrações opostas nessas duas linhagens, ou seja, concentrações aumentadas foram observadas na célula mutante que apresenta queda de CLS e diminuídas na mutante que apresenta maior CLS. A cascata de sinalização TOR interfere no CLS de células eucarióticas, incluindo a levedura S. cerevisiae. A ativação dessa via está associada à diminuição do CLS e sua inibição ao aumento. Tomando por base os dados obtidos e dando continuidade aos achados acima descritos, o objetivo deste projeto será bioquimicamente validar os dados obtidos no estudo proteômico. Esses estudos implicam na deleção e/ou superexpressão dos genes que expressam as proteínas em questão, avaliar a ativação de elementos da cascata TOR através de ensaios de imunomarcação e avaliar a expressão desses genes por RT-PCR.