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Inserção de gene repórter fluorescente em região gênica de Sox2 para estudo da diferenciação celular no desenvolvimento embrionário inicial bovino

Processo: 19/03014-9
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de junho de 2019
Vigência (Término): 31 de maio de 2021
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Pesquisador responsável:Marcelo Demarchi Goissis
Beneficiário:Felipe Eduardo Luedke
Instituição-sede: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:17/09576-3 - Estudos sobre mecanismos de diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário inicial em bovinos, AP.JP
Assunto(s):Diferenciação celular   Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas   Blastocisto   Proteína 9 associada à CRISPR

Resumo

A separação entre massa interna celular (MCI) e trofectoderma (TE) é o primeiro evento de diferenciação celular que ocorre no embrião mamífero. Nestes eventos iniciais, ocorre uma expressão coordenada de diversos genes. Falhas nestes processos de desenvolvimento inicial podem ocasionar perdas embrionárias e consequentemente econômicas. Os estudos sobre a diferenciação celular em bovinos ainda são escassos, refletindo em baixos índices de sucesso na produção de embriões bovinos in vitro. As técnicas para estudo dos embriões normalmente envolvem a destruição dos mesmos e não permitem acompanhar em tempo real a dinâmica dos genes relacionados à diferenciação em MCI e TE. Novas técnicas como CRISPR/Cas9 permitem alteração direcionada da sequência de DNA genômico. A introdução direcionada de proteínas fluorescentes repórteres permitiria a visualização em tempo real da expressão de genes de interesse nos embriões. Pretende-se realizar edição gênica nas regiões dos genes Sox2 para a introdução de proteínas fluorescentes por recombinação homóloga. Pretende-se ainda, comparar a eficiência da edição gênica em diferentes momentos do desenvolvimento embrionário. Os experimentos envolverão técnicas de clonagem molecular, microinjeção de embriões e microscopia de fluorescência. Espera-se com este projeto desenvolver uma ferramenta para introdução direcionada de genes repórteres em embriões bovinos e ao mesmo tempo, compreender os mecanismos de diferenciação celular, contribuindo para a melhoria dos protocolos de produção in vitro de embriões.