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Evolução Dirigida da L-Asparaginase para Aprimoramento de sua Estabilidade In Vivo

Processo: 19/09354-6
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Mestrado
Vigência (Início): 16 de setembro de 2019
Vigência (Término): 01 de março de 2020
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Gisele Monteiro
Beneficiário:Guilherme Meira Lima
Supervisor no Exterior: Ratmir Derda
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Local de pesquisa : University of Alberta, Canadá  
Vinculado à bolsa:18/15041-8 - Expressão de L-asparaginase de Erwinia chrysanthemi em tecnologia de síntese proteica livre de células, BP.MS
Assunto(s):Asparaginase   Evolução   Estabilidade

Resumo

L-asparaginase (L-ASNase) é um componente primordial no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA). A introdução deste produto biotecnológico em protocolos médicos pediátricos foi capaz de melhorar as taxas de sobrevida de pacientes acometidos com a doença a valores próximos a 90%. Contudo, a maioria das L-ASNases no mercado, especialmente a L-ASNase isolada de Erwinia chrysanthemi, são altamente imunogênicas e possuem um tempo curto de meia-vida, dificultando o tratamento da LLA, particularmente em pacientes adultos. Mecanismos de eliminação do biofármaco como formação de anticorpos e degradação proteica por proteases lisossomais são algumas das principais razões responsáveis pelos problemas mencionados. Uma L-ASNase com maior estabilidade in vivo é, portanto, necessária. Evolução dirigida poderia ser usada como uma estratégia de engenharia a fim de se desenvolver versões melhoradas da L-ASNase. Neste contexto, nós propomos criar novas versões mutantes de L-ASNase expressas na plataforma de síntese proteica livre de células com maior estabilidade biológica através de ciclos iterativos de mutações, seguido por seleção artificial in vitro e in vivo. Uma biblioteca de genes de L-ASNase mutantes criada anteriormente por nosso laboratório será usada e cada variante expressa será selecionada em função de sua atividade enzimática, nível de expressão e estabilidade em soro humano. Finalmente, cada mutante de L-ASNase viável será modificada quimicamente e ligada a fagos M13. Os produtos resultantes serão combinados e injetados em camundongos, de forma que as variantes mais estáveis sejam selecionadas e usadas como ponto de partida para o próximo ciclo de mutações através de reações de mutação sítio-dirigidas. Essa estratégia poderia elucidar importantes propriedades estruturais da L-ASNase e criar variantes mais adequadas para aplicações médicas no futuro.