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Desenvolvimento de plataformas de diagnóstico uniplex e multiplex para infecção com arbovírus utilizando proteínas recombinantes

Processo: 19/16049-5
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
Vigência (Início): 11 de novembro de 2019
Vigência (Término): 10 de novembro de 2020
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
Pesquisador responsável:Luis Carlos de Souza Ferreira
Beneficiário:Robert Andreata Santos
Supervisor no Exterior: Jean-Claude Manuguerra
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Local de pesquisa : Institut Pasteur, França  
Vinculado à bolsa:16/23560-0 - Desenvolvimento de plataformas de diagnóstico uniplex e multiplex para infecção com arbovírus utilizando proteínas recombinantes, BP.DR
Assunto(s):Febre de Chikungunya   Proteínas recombinantes   Epidemiologia   Vírus Zika   Dengue   Virologia   Testes sorológicos

Resumo

O objetivo do principal projeto de pesquisa relacionado à presente proposta é desenvolver e validar plataformas de diagnóstico específicas de baixo custo, baseadas em proteínas recombinantes, e projetadas para detecções uniplex e multiplex de infecções arbovirais. Para atingir o objetivo proposto as proteínas ”NS1 de DENV e ZIKV foram alvo, uma vez que estas foram normalmente utilizadas na detecção de anticorpos DENV.Nossos resultados demonstraram que o antígeno recombinante que cobre a região C-terminal da proteína NS1 preserva a antigenicidade e concentra a maioria dos epitopos conformacionais que conferem especificidade aos anticorpos gerados durante a infecção, uma vez que foi encontrada reatividade semelhante quando comparada às versões inteiras e truncadas da proteína (número de patente: BR102016011318-0). Isto é suportado pela identificação de epítopos conformacionais presentes na proteína, os quais são capazes de serem reconhecidos pelas células B do sistema imunológico. No entanto, um alto reconhecimento de amostras positivas para DENV pode ser observado ao avaliar toda a proteína NS1, com uma redução drástica no reconhecimento dos mesmos soros ao avaliar a proteína ”NS1. Além disso, como demonstrado por Song e colegas, a região que engloba a proteína ”NS1 tem potencial estrutural e cargas superficiais eletrostáticas capazes de promover a diferenciação entre anticorpos dirigidos contra DENV ou ZIKV (SONG et al., 2016).A visita ao laboratório do Dr. Jean-Claude Manuguerra objetivou a padronização do teste utilizando as proteínas ZIKV e DENV1-4 na plataforma de diagnóstico multiplex previamente descrita pela CIBU (CAO-LORMEAU et al., 2016; AUBRY et al., 2017 ). A caracterização preliminar enfrentou dificuldades previstas pelo teste ELISA padronizado, uma vez que aregião C-terminal da proteína NS1 reduz drasticamente a reatividade cruzada, mas não a extingue, e a detecção de reatividade no ensaio Luminex é muito mais sensível do que nos testes ELISA. . Assim, foi observada reação cruzada entre amostras positivas para DENV e proteína ”NS1 do ZIKV, mas não no sentido contrário, uma vez que as amostras positivas para ZIKV testadas foram positivas apenas para o ZIKV.Como tentativa de detectar anticorpos presentes em condições de infecções agudas, a presença de IgG3 específica foi avaliada nas amostras, conforme demonstrado em estudo epidemiológico comparativo entre o DENV e o ZIKV (RODRIGUEZ-BARRAQUER et al., 2019). A detecção clássica de doenças de fase aguda é confirmada pela presença de anticorpos IgM específicos no soro de pacientes suspeitos devido à infecção por DENV ou ZIKV. No entanto, tal detecção nem sempre é possível de ser realizada de maneira específica e sensível, uma vez que a inativação e / ou depleção de IgG tornam os testes inviáveis. Os resultados mostraram a capacidade de detectar IgG3 em amostras agudas para infecção por ZIKV. Um maior acompanhamento de cada caso é necessário para a avaliação do aumento da reatividade após a infecção, assim como a sua redução após 6 meses.Com o objetivo de desenvolver ainda mais o ensaio multiplex gerado com as proteínas ”NS1, bem como inserir a proteína E2 CHIV na detecção do Luminex, entramos em contato com o laboratório do Dr. Jean-Claude Manuguerra para propor um longo estágio na unidade CIBU. Esperamos que os antígenos do nosso projeto sejam padronizados com sucesso na plataforma Luminex com a capacidade de diferenciar entre diferentes infecções por arbovírus em um único teste. Por todas essas razões, acreditamos que a bolsa necessária será traduzida para avanços significativos no campo, permitindo estudos prospectivos e retrospectivos de arboviroses epidemiológicos, bem como o monitoramento de prováveis surtos.