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Tipo de amostra e horário de coleta do conteúdo ruminal para a identificação e quantificação de archaeas em bovinos

Processo: 19/11484-5
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de agosto de 2019
Vigência (Término): 31 de julho de 2020
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Zootecnia - Nutrição e Alimentação Animal
Pesquisador responsável:Telma Teresinha Berchielli
Beneficiário:Yasmin Andrade Pinheiro
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Jaboticabal. Jaboticabal , SP, Brasil
Assunto(s):Microbiologia   Reação em cadeia por polimerase (PCR)   Fermentação ruminal   Rúmen   Archaea   Gado Nelore

Resumo

O objetivo deste estudo é comparar o uso de três tipos de amostra (fração liquida, fração sólida e fração liquida+sólida) e três horários (0, 4 e 8h após alimentação) de coleta de conteúdo ruminal, para identificar e quantificar a população total de Archaeas metanogénicas em bovinos mediante métodos moleculares. Serão utilizados 4 bovinos Nelore canulados no rúmen (peso corporal médio de 445 kg e idade média de 24 meses) recebendo uma dieta com 50% de silagem de milho como fonte de volumoso e 50% de concentrado composto por milho moído, grãos secos por destilação oriundo do processamento do milho (DDG), ureia e 100 g/d de suplemento mineral. Após 21 dias de adaptação dos animais a dieta, via cânula ruminal serão coletadas amostras de conteúdo ruminal (500 g/animal) na região ventral do rúmen as 0, 4 e 8h após alimentação. As amostras serão imediatamente refrigeradas e levadas ao laboratório para o processamento. Após homogeneização cada amostra será dividida em três frações: 1) fração solida+liquida: 50 g de conteúdo ruminal. 2) fração liquida: 50 mL de liquido ruminal obtido a partir da filtragem do conteúdo ruminal em pano de 100 micras. 3) fração solida: 50 g de conteúdo ruminal seco, correspondente ao resíduo solido restante após filtragem em pano de 100 micras. A cada fração será a adicionado 50 mL de tampão fosfato-salino (PBS, pH 7,4) a 4°C, em seguida a mistura será homogeneizada mediante leve agitação manual por 3 minutos. Posteriormente o material será filtrado em tecido com malha de 100 micras. O filtrado será submetido à centrifugação de 8000 x g por 30 minutos a temperatura de 4ºC e o sobrenadante será descartado. A extração do DNA será realizada utilizando 250 mg do pellet obtido, e o método de qPCR será utilizado para a identificação e quantificação das bactérias totais e a abundância das Archaeas usando o método 2-””Ct. As leituras de absorbância relativa do DNA, o rendimento aparente e as proporções de Archaeas metanogénicas serão comparadas entre os métodos de coleta (frações) e tempos de coleta (horários) pelo teste de Friedman pós-teste de Dunns. Desta forma, o projeto pretende contribuir para o conhecimento de metodologias de coleta apropriadas para a quantificação molecular de Archaeas metanogénicas em ruminantes.