Padronização das condições de amplificação e sequenciamento para a análise de metilação dos genes LDLr, PCSK9 e LDLRAP1

• Processo: 19/16967-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Vigência (Início): 01 de agosto de 2019
• Vigência (Término): 17 de janeiro de 2021
• Área do conhecimento: Ciências da Saúde - Farmácia
• Pesquisador responsável: Mario Hiroyuki Hirata
• Beneficiário: Daiana Vitor de Oliveira Silva
• Instituição Sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 16/12899-6 - Caracterização genômica, epigenômica e farmacogenômica de portadores de hipercolesterolemia familial na população brasileira, AP.TEM
• Assunto(s): Hipercolesterolemia Metilação de DNA Amplificação de genes Análise de sequência de DNA
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Hipercolesterolemia familial | metilação de DNA | sequenciamento | Analises Clínicas - Biologia Molecular

Resumo

A hipercolesterolemia familial (HF) é uma doença autossômica dominante que afeta o metabolismo do colesterol e resulta na diminuição do catabolismo das partículas de LDL e elevando sua concentração plasmática. O fenótipo clínico da HF é resultante da presença de variantes em genes relacionados com a doença, como o receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDLR), a apoliproteína B (APOB) e a proteína convertase subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9). Entretanto, outros genes, como LDLRAP1 vêm sendo associados com as alterações fenotípicas que ocorrem na hipercolesterolemia autossômica recessiva (ARH). Apesar dos avanços das tecnologias de sequenciamento de DNA que revolucionou o diagnóstico molecular, quando se fala de herdabilidade dos traços lípidos no sangue, a ausência de alterações na sequência gênica que justifique a alteração fenotípica de HF pode chegar a atingir 40%. Nos últimos anos, tem-se buscado respostas para a variabilidade fenotípica não explicada pela genômica estrutural. Entre essas respostas, estão os mecanismos epigenéticos, conhecidos como processos biológicos envolvidos no controle de transcrição e tradução, dos quais destaca-se a metilação do DNA. A metilação do DNA refere-se ao processo no qual ocorre a transferência de um grupo metil (CH3) para o carbono 5 de uma citosina seguida de guanina, o qual se nomeia sitio CpG. No genoma, os sítios CpG podem ocorrer isolados ou agrupados em regiões denominadas de ilhas CpG, predominantemente na região promotora dos genes. A metilação nessa região resulta em silenciamento gênico, uma vez que impedem a ligação dos fatores de transcrição às regiões regulatórias do gene. Assim, os estudos epigenéticos são de suma importância para compreender melhor os mecanismos fisiopatológicos e possibilitar o desenvolvimento de novos métodos para a prevenção, prognóstico e terapia das doenças doenças cardiovasculares. O objetivo desse estudo é padronizar as condições de amplificação e sequenciamento para a análise de metilação dos genes LDLR, PCSK9 e LDLRAP1. Amostras de DNA genômico isoladas utilizando o kit QIAmp DNA Blood Maxi Kit (Qiagen) serão convertidas utilizando os reagentes do kit EpiTect Fast DNA Bisulfite Conversion (Qiagen). Para a etapa de amplificação pela PCR somente serão utilizadas amostras com concentração final (após a conversão com bissulfito) e 15ng/µl. O DNA convertido será submetido ao processo de amplificação pela PCR, utilizando os reagentes do PyroMark PCR Kit (Qiagen) e os iniciadores de amplificação para cada gene que será analisado, contidos nos ensaios PyroMark CpG Assays (Qiagen). Na etapa da PCR serão padronizados os seguintes parâmetros: (1) Concentração e temperatura de hibridização de cada ensaio PyroMark CpG Assay; (2) Input de DNA convertido. Na etapa de sequenciamento, serão padronizadas as condições do pirossequenciamento utilizando a plataforma PyroMark Q24 (Qiagen). Serão avaliados os seguintes parâmetros: (1) Input do produto de PCR e (2) concentração do primer de sequenciamento.