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Evolução dirigida de uma beta-galactosidase de Xanthomonas axonopodis pv. citri

Processo: 19/15810-4
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de novembro de 2019
Vigência (Término): 30 de abril de 2020
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
Pesquisador responsável:Mário Tyago Murakami
Beneficiário:Plínio Salmazo Vieira
Supervisor no Exterior: Miguel Alcalde Galeote
Instituição-sede: Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM). Ministério da Ciência, Tecnologia, Inovações e Comunicações (Brasil). Campinas , SP, Brasil
Local de pesquisa : Instituto de Catálisis y Petroleoquímica (ICP), Espanha  
Vinculado à bolsa:16/06509-0 - Entendimento do sistema enzimático envolvido na degradação e utilização de xiloglicanas do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri, BP.PD
Assunto(s):Enzimologia   Elementos estruturais de proteínas   Mutagênese

Resumo

As paredes celulares primárias das plantas são compostas principalmente por celulose e hemicelulose, tendo o xiloglicano (XyG) como o principal polissacarídeo hemicelulósico. A estrutura e composição da XyG varia muito de acordo com o tipo de planta e tecido, necessitando de um repertório diverso e complexo de glicosil hidrolases para sua completa despolimerização. O gênero Xanthomonas se apresenta como uma das bactérias patogênicas mais difundidas, que empregam um arsenal de hidrolases para invadir e modular a resposta das plantas, além de contribuir para a ingestão de carboidratos como sua fonte primária de carbono. Por meio da anotação do genoma e análise transcriptômica, detectou-se um operon dedicado à degradação do xiloglicano e que pode ser explorado para fins biotecnológicos. No entanto, devido às condições ótimas moderadas destas GHs identificadas, é necessário o uso de engenharia molecular para alcançar as condições propriamente industriais. Desta forma, este projeto propõe o uso do redesenho do sítio ativo por técnicas computacionais e evolução dirigida in vitro para melhorar as características de uma das enzimas deste operon de Xac para a degradação do XyG, em particular uma nova beta-galactosidase promíscua que se baseia em um domínio auxiliar CBM-like para formar seu sítio ativo. A estratégia empregará o uso combinado de mutagênese aleatória e de saturação local, recombinação de DNA e ferramentas de modelagem/simulação para alcançar excelente estabilidade térmica, termofilicidade e promiscuidade do substrato, tornando a enzima adequada para possíveis aplicações industriais sustentáveis e de baixo custo. Os mutantes obtidos serão caracterizados através de ensaios de atividade e estabilidade para determinar seu pH e temperatura ótimos, além de sua preferência e afinidade por múltiplos substratos.