Evolução dirigida de uma beta-galactosidase de Xanthomonas axonopodis pv. citri

• Processo: 19/15810-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Vigência (Início): 01 de novembro de 2019
• Vigência (Término): 14 de março de 2020
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Mário Tyago Murakami
• Beneficiário: Plínio Salmazo Vieira
• Supervisor: Miguel Alcalde Galeote
• Instituição Sede: Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM). Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação (Brasil). Campinas , SP, Brasil
• Local de pesquisa: Instituto de Catálisis y Petroleoquímica (ICP), Espanha
• Vinculado à bolsa: 16/06509-0 - Entendimento do sistema enzimático envolvido na degradação e utilização de xiloglicanas do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri, BP.PD
• Assunto(s): Enzimologia Elementos estruturais de proteínas Mutagênese Bioquímica de proteínas Evolução dirigida
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Enzimologia | estrutura de proteínas | Evolução dirigida | hidrolases glicosídicas | Mutagênese | Bioquímica de proteínas

Resumo

As paredes celulares primárias das plantas são compostas principalmente por celulose e hemicelulose, tendo o xiloglicano (XyG) como o principal polissacarídeo hemicelulósico. A estrutura e composição da XyG varia muito de acordo com o tipo de planta e tecido, necessitando de um repertório diverso e complexo de glicosil hidrolases para sua completa despolimerização. O gênero Xanthomonas se apresenta como uma das bactérias patogênicas mais difundidas, que empregam um arsenal de hidrolases para invadir e modular a resposta das plantas, além de contribuir para a ingestão de carboidratos como sua fonte primária de carbono. Por meio da anotação do genoma e análise transcriptômica, detectou-se um operon dedicado à degradação do xiloglicano e que pode ser explorado para fins biotecnológicos. No entanto, devido às condições ótimas moderadas destas GHs identificadas, é necessário o uso de engenharia molecular para alcançar as condições propriamente industriais. Desta forma, este projeto propõe o uso do redesenho do sítio ativo por técnicas computacionais e evolução dirigida in vitro para melhorar as características de uma das enzimas deste operon de Xac para a degradação do XyG, em particular uma nova beta-galactosidase promíscua que se baseia em um domínio auxiliar CBM-like para formar seu sítio ativo. A estratégia empregará o uso combinado de mutagênese aleatória e de saturação local, recombinação de DNA e ferramentas de modelagem/simulação para alcançar excelente estabilidade térmica, termofilicidade e promiscuidade do substrato, tornando a enzima adequada para possíveis aplicações industriais sustentáveis e de baixo custo. Os mutantes obtidos serão caracterizados através de ensaios de atividade e estabilidade para determinar seu pH e temperatura ótimos, além de sua preferência e afinidade por múltiplos substratos.