Clonagem e expressão do fragmento da proteína gigante de Trypanosoma cruzi para estudos de interação com as proteínas do citoesqueleto

• Processo: 19/11047-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2019
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2022
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Munira Muhammad Abdel Baqui
• Beneficiário: Aylla Salomão Krebs Von Ermland
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Assunto(s): Clonagem Citoesqueleto Cisteína proteases Trypanosoma cruzi Caracterização estrutural Proteínas recombinantes CRISPR-Cas9 Espectrometria de massas Western blotting Imunofluorescência
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Citoesqueleto | proteína recombinante | Trypanosoma cruzi | Zona de adesão flagelar- FAZ | Tripanossomatídeos

Resumo

O Trypanosoma cruzi, protozoário da família Trypanosomatidae, é o causador da Doença de Chagas, doença infecciosa responsável pela morte de milhões de pessoas pelo mundo. Nos tripanossomatídeos, dentre eles o T. cruzi, foi demonstrada a presença de uma família de proteínas gigantes (PGs) de alta massa molecular (e 500 kDa), localizada na Zona de Adesão Flagelar (FAZ). Esta região tem o papel de conectar o corpo celular ao flagelo, desempenhando inúmeras funções na sobrevivência do parasito. O screening por espectrometria de massas (MS) de proteínas de alta massa molecular presentes no citoesqueleto de T. cruzi revelou proteínas pertencentes ao grupo de cisteínas proteases, uma delas a calpaína-like cisteína peptidase (CLP) (519 kDa) ainda não caracterizada. O presente projeto de Iniciação Científica tem como objetivo clonar um fragmento da CLP, no vetor de expressão pGEX-4T1 em fusão ao GST (Glutationa S-Transferase) no N-terminal, permitindo a expressão e obtenção da proteína recombinante. A proteína recombinante será utilizada para produzir anticorpos policlonais específicos e, consequentemente, utilizá-los em ensaios de western blotting e imunofluorescência e co-imunoprecipitação. Além disso, ensaios de pull-down utilizando a proteína de fusão serão realizados para buscar parceiros que interagem com essa CLP no citoesqueleto do T. cruzi. O presente projeto está alinhado ao projeto de Doutorado de Lays A. M. Trajano Silva, que analisa a função dessa e de outras proteínas gigantes de T. cruzi através da edição do genoma utilizando CRISPR/Cas9. Este projeto de Iniciação Científica dará suporte aos estudos que estão sendo desenvolvidos no laboratório para caraterização de PGs em T. cruzi, que devem desempenhar um papel importante no processo de divisão e diferenciação do parasito.