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Clonagem e expressão do fragmento da proteína gigante de Trypanosoma Cruzi para estudos de interação com as proteínas do citoesqueleto

Processo: 19/11047-4
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de novembro de 2019
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2020
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
Pesquisador responsável:Munira Muhammad Abdel Baqui
Beneficiário:Aylla Salomão Krebs Von Ermland
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Clonagem   Citoesqueleto   Cisteína proteases   Trypanosoma cruzi   Caracterização estrutural   Proteínas recombinantes   CRISPR-Cas9   Espectrometria de massas   Western blotting   Imunofluorescência

Resumo

O Trypanosoma cruzi, protozoário da família Trypanosomatidae, é o causador da Doença de Chagas, doença infecciosa responsável pela morte de milhões de pessoas pelo mundo. Nos tripanossomatídeos, dentre eles o T. cruzi, foi demonstrada a presença de uma família de proteínas gigantes (PGs) de alta massa molecular (e 500 kDa), localizada na Zona de Adesão Flagelar (FAZ). Esta região tem o papel de conectar o corpo celular ao flagelo, desempenhando inúmeras funções na sobrevivência do parasito. O screening por espectrometria de massas (MS) de proteínas de alta massa molecular presentes no citoesqueleto de T. cruzi revelou proteínas pertencentes ao grupo de cisteínas proteases, uma delas a calpaína-like cisteína peptidase (CLP) (519 kDa) ainda não caracterizada. O presente projeto de Iniciação Científica tem como objetivo clonar um fragmento da CLP, no vetor de expressão pGEX-4T1 em fusão ao GST (Glutationa S-Transferase) no N-terminal, permitindo a expressão e obtenção da proteína recombinante. A proteína recombinante será utilizada para produzir anticorpos policlonais específicos e, consequentemente, utilizá-los em ensaios de western blotting e imunofluorescência e co-imunoprecipitação. Além disso, ensaios de pull-down utilizando a proteína de fusão serão realizados para buscar parceiros que interagem com essa CLP no citoesqueleto do T. cruzi. O presente projeto está alinhado ao projeto de Doutorado de Lays A. M. Trajano Silva, que analisa a função dessa e de outras proteínas gigantes de T. cruzi através da edição do genoma utilizando CRISPR/Cas9. Este projeto de Iniciação Científica dará suporte aos estudos que estão sendo desenvolvidos no laboratório para caraterização de PGs em T. cruzi, que devem desempenhar um papel importante no processo de divisão e diferenciação do parasito. (AU)