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Desenvolvimento de uma metodologia CRISPR/Cas9 simplificada e inovadora para edição genômica em Bacillus amyloliquefaciens FZB42: uma alternativa para o biocontrole de patógenos agrícolas

Processo: 19/03199-9
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de dezembro de 2019
Vigência (Término): 30 de novembro de 2021
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Frederico José Gueiros Filho
Beneficiário:João Costa Filho
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas   Proteína 9 associada à CRISPR   Controle biológico   Engenharia genética

Resumo

A produção agrícola é constantemente afetada pela ocorrência de pragas nas lavouras, causando perdas econômicas e instabilidade na produção de alimentos. Uma alternativa para minimizar esses problemas é o desenvolvimento de pesquisas que possam potencializar a capacidade de biocontrole de cepas de Bacillus amyloliquefaciens, como a edição genômica usando a inovadora técnica CRISPR/Cas9. Nesse sentido, o principal objetivo dessa proposta é desenvolver uma metodologia simplificada eficiente e inovadora de edição genômica com o sistema CRISPR/Cas9 in vitro e aplicá-la na otimização a produção de metabólitos bioativos em B. amyloliquefaciens FZB42. A metodologia proposta tem como principal diferencial ser independente de plasmídeos e utilizar complexos ribonucleoprotéicos (RNPs) produzidos in vitro a partir de moléculas de gRNA e proteína Cas9 purificados. B. amyloliquefaciens FZB42 terá o genoma editado para otimizar os operons srf e bac, promovendo aumento da expressão de surfactina e bacilisina, dois metabólitos com atividade antibacteriana e antifúngica importantes para biocontrole. O promotor Psrf do operon srf será substituído pelo promotor constitutivo P43, que é conhecido por apresentar alto nível de expressão na fase exponencial e estacionária de crescimento para B. subtilis. A alteração do operon bac será feita pela otimização da sequência RBS (Ribosomal Binding Site) e eliminação do primeiro sítio de ligação do regulador negativo ScoC, no promotor Pbac. A cepa obtida será analisada quanto à produção da surfactina e bacilisina, bem como utilizada em experimentos para verificar a capacidade antimicrobiana frente exposição com Rhizoctonia solani e Agrobacterium tumefaciens. A execução desse trabalho também criará a possibilidade de utilizar a metodologia CRISPR/Cas9 aqui desenvolvida em outras espécies bacterianas, inclusive aquelas que não dispõem de sistemas genéticos bem estabelecidos.