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Comparação dos efeitos em canais NaV entre a Ts5 recombinante e nativa, presente na peçonha do escorpião Tityus serrulatus

Processo: 19/24980-0
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Iniciação Científica
Vigência (Início): 08 de janeiro de 2020
Vigência (Término): 07 de março de 2020
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Farmácia - Análise Toxicológica
Pesquisador responsável:Eliane Candiani Arantes Braga
Beneficiário:Nádia Mayumi Vilela Bartnick Tanaka
Supervisor no Exterior: Jan Tytgat
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Local de pesquisa : University of Leuven (KU Leuven), Bélgica  
Vinculado à bolsa:18/11739-0 - Expressão heteróloga em Pichia pastoris e purificação da toxina His-TEV-Ts5, um componente da peçonha de Tityus serrulatus, BP.IC
Assunto(s):Canais de sódio   Pichia pastoris   Tityus serrulatus

Resumo

O escorpião Tityus serrulatus é considerado a espécie mais perigosa para humanos no Brasil. Sua peçonha contém diversos componentes com diferentes potenciais de aplicação. Dentre esses componentes, há a família das ±-neurotoxinas, que são toxinas capazes de interagir com canais para sódio dependentes de voltagem (canais Nav). Essas toxinas são as principais responsáveis pela toxicidade da peçonha de escorpião. A Ts5 é uma ±-neurotoxina extremamente tóxica e que representa somente 2% do total da peçonha solúvel do T. serrulatus. Essa toxina pode ser classificada como uma ±-like toxina, devido a sua capacidade de interagir com canais Nav de mamíferos e de insetos, o que confere a ela uma potencial aplicação como inseticida. Para produzir a Ts5 em quantidades suficientes que permitam estudos mais aprofundados sobre ela, a expressão heteróloga em sistema de Pichia pastoris é uma ótima ferramenta que pode ser utilizada. Para isso, o vetor recombinante "pPICZ±A-His-TEV-Ts5" será desenhado com componentes (His-tag e sítio de clivagem da TEV) que facilitem processos de purificação. A expressão da toxina recombinante será induzida por metanol durante 144 horas, e a purificação do sobrenadante final será feita por IMAC e cromatografia de fase reversa. Após esses processos de purificação, a His-tag será clivada da proteína recombinante através de uma digestão com a enzima TEV, o que irá liberar a toxina em uma forma mais similar à nativa. Posteriormente, a proteína recombinante deve ser analisada para verificar se apresenta os mesmos efeitos em canais Nav que a toxina nativa apresenta. Para realizar essa análise, oócitos de Xenopus laevis serão utilizados para expressar canais Nav em sua membrana, através da injeção de cRNAs. Após essa expressão, a toxina será adicionada à uma câmara contendo os oócitos e a caracterização eletrofisiológica será realizada utilizando a técnica Voltage clamp com dois microeletrodos. Portanto, esse projeto visa analisar os efeitos da r-Ts5 nos canais Nav1.3, Nav1.6, Nav1.7 e DmNav1, e comparar com os efeitos provocados pela Ts5 nativa.