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Desenvolvimento de um sistema CRISPR-Cas induzível para RNA em Trypanosoma cruzi

Processo: 19/23180-0
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de maio de 2020
Vigência (Término): 31 de outubro de 2020
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Ariel Mariano Silber
Beneficiário:Janaina de Freitas Nascimento
Supervisor no Exterior: John Morrison Kelly
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Local de pesquisa : London School of Hygiene and Tropical Medicine, Inglaterra  
Vinculado à bolsa:17/12320-0 - Caracterização e papel biológico do catabolismo de histidina em Trypanosoma cruzi, BP.PD
Assunto(s):Biologia molecular   Trypanosoma cruzi   RNA   Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas

Resumo

Nos últimos 30 anos, os estudos de função gênica em tripanosomatídeos empregaram ferramentas como expressão heteróloga, superexpressão e nocaute de genes. A recente adaptação do sistema bacteriano CRISPR-Cas como ferramenta molecular expandiu a caixa de ferramentas para manipulação genética nesses organismos. No entanto, até agora, todos os sistemas CRISPR-Cas que foram modificados para permitir a manipulação da expressão gênica em Trypanosoma cruzi tem DNA como alvo. Há duas grandes desvantagens nesses sistemas: ou eles exigem a seleção dos parasitas mutantes com antibióticos ou uma triagem extensiva para encontrar os parasitas com a mutação correta. Até o momento, não existe um sistema induzível e regulável disponível para induzir a redução na expressão gênica em T. cruzi. Assim, torna-se impossível estudar genes essenciais à viabilidade do parasita e os quais nocaute gênico completo não seria tolerado pela célula. Aqui, propomos o desenvolvimento de um sistema induzível de CRISPR-Cas direcionado a RNA para uso em T. cruzi com base nos sistemas bacterianos de CRISPR-Cas9 e Cas13 que possuem atividade de clivagem de RNA descrita. Como alvo inicial, propomos a primeira enzima da via de degradação de His, a histidina amônia liase - TcHAL, uma vez que esta não é essencial para a viabilidade do parasita. Esse sistema facilitará a investigação dos fenótipos associados à redução da expressão das enzimas envolvidas nas reações bioquímicas cruciais para a sobrevivência do T. cruzi. Além do knockdown da expressão gênica, os usos de um sistema induzível CRISPR-Cas direcionado ao RNA incluiriam a facilitação de screenings de perda e ganho de função de todo o genoma, que teriam muitas aplicações, incluindo estudos sobre o modo de ação de drogas. (AU)