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Análise estrutura-função do domínio extracelular da molécula de adesão roughest de Drosophila melanogaster utilizando a metodologia de CRISPR/Cas9

Processo: 19/05214-5
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de fevereiro de 2020
Vigência (Término): 31 de maio de 2021
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Morfologia - Embriologia
Pesquisador responsável:Ricardo Guelerman Pinheiro Ramos
Beneficiário:Giulia Covolo Spegiorim
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Biologia do desenvolvimento   Proteína 9 associada à CRISPR   Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas   Matriz extracelular   Adesão celular   Drosophila melanogaster   CRISPR-Cas9

Resumo

O gene roughest (rst) apresenta caráter pleiotrópico, tendo seu envolvimento descrito em diversos processos do desenvolvimento de Drosophila melanogaster, tais como direcionamento axonal, histólise de glândulas salivares, fusão de mioblastos durante a formação da musculatura embrionária e diferenciação das células pigmentares durante o processo de desenvolvimento do olho composto. O gene codifica uma proteína transmembrana unipasso, com cinco domínios imunoglobulinas na porção extracelular (509 aminoácidos) e uma cauda citoplasmática (208 aminoácidos) contendo diversos resíduos de serina e treonina fosforiláveis e com subdomínios funcionalmente importantes - como uma região rica em glutaminas conhecida como domínio opa-like, e um domínio PDZ na porção C-terminal da proteína. Foi observado que a superexpressão de construções que deletam parcial ou totalmente a região intracelular da proteína levaram a defeitos na histólise da glândula salivar larval, na formação do olho composto, bloqueio na celularização da blastoderme e interferência na formação embrionária da linha média do sistema nervoso central. Ainda não são conhecidos, no entanto, os fenótipos consequentes da deleção completa ou parcial dos domínios imunoglobulina extracelulares da proteína Roughest. Assim, com o objetivo de compreender o papel funcional desses domínios, duas construções serão feitas com o uso da tecnologia CRISPR/Cas9: um alvo deletando 441 aminoácidos da região extracelular, e outro que delete parcialmente apenas os dois primeiros domínios imunoglobulina da região N-terminal, mantendo a sequência espaçadora de glicina e deletando 149 aminoácidos. Ambas as deleções se iniciam 60 aminoácidos após o codon de iniciação e mantém a região transmembrana e o peptídeo sinal. Dessa forma, será possível observar se tais deleções serão responsáveis por gerar diferentes fenótipos, ou fenótipos similares aos já conhecidos com as deleções de outras regiões da proteína (ou em linhagens deficientes de rst).

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