Edição genética e seleção independente de droga em Trypanosoma cruzi: nova metodologia para modificações por CRISPR/Cas9

• Processo: 19/17328-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2020
• Data de Término da vigência: 30 de junho de 2022
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Simone Guedes Calderano
• Beneficiário: Bruno Alves Santarossa
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Biologia molecular Clonagem Proteína 9 associada à CRISPR Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas CRISPR-Cas9 Trypanosoma cruzi
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cas9 | Crispr | cruzi | Seleção sem antibióticos | T | Biologia Molecular

Resumo

O Trypanossoma cruzi é o causador de chagas, uma importante doença endêmica com maior proeminência em países tropicais, sendo considerada uma doença negligenciada pela Organização Mundial de Saúde (OMS). Dessa forma o estudo e entendimento desse parasita são imprescindíveis para desenvolver novos e melhores tratamentos. A edição genética por CRISPR/Cas9 aliada a utilização de gene de resistência à droga é amplamente usada e validada como instrumento de seleção positiva de T. cruzi recombinantes. Contudo apresenta alguns problemas como o alto custo das drogas utilizadas, a dificuldade de fazer múltiplas marcações em diferentes genes, pincipalmente por conta da baixa variedade de antibióticos disponíveis, além de resultar na mudança das UTRs dos genes alvos, que são importantes para a estabilidade e modulação traducional dos mRNAs deste parasito. Visto essas dificuldades, esse projeto tem como objetivo validar a adição de sequências de tags nos genes alvos sem adição de gene de resistência à droga, e com seleção clonal de parasitos recombinantes. A partir da ferramenta CRISPR/Cas9 e de produtos de PCR será realizada a inserção de sequências de tags na porção 5' ou 3' dos genes alvo, com o mínimo de modificações possíveis nas UTRs desses genes. Após processo de clonagem, as populações clonais positivas serão identificadas e a expressão avaliada. Também será avaliada a possibilidade de modificação simultânea de diferentes genes com a técnica aqui proposta.