Desenvolvimento de kits liofilizados para síntese de proteínas livres de células (CFPS), Syntheasy

• Processo: 20/08131-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pesquisa Inovativa em Pequenas Empresas - PIPE
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2020
• Data de Término da vigência: 31 de março de 2021
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica
• Pesquisador responsável: Natalia Marchesan Bexiga
• Beneficiário: Natalia Marchesan Bexiga
• Empresa: Biolinker Biologia Sintética Eireli
• CNAE: Pesquisa e desenvolvimento experimental em ciências físicas e naturais ; Atividades de serviços de complementação diagnóstica e terapêutica
• Vinculado ao auxílio: 19/16625-6 - Desenvolvimento de kits liofilizados para síntese de proteínas livres de células (CFPS), Syntheasy, AP.PIPE
• Assunto(s): Biologia sintética Liofilização Proteínas recombinantes Sistema livre de células Moléculas bioativas Escherichia coli
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: biomoléculas | cell-free | coli | E | liofilização | Proteinas recombinantes | Biologia sintética

Resumo

Os componentes do kit Syntheasy, produzidos e comercializados pela BioLinker Biologia sintética, LTDA (CNPJ 31.021.329/0001-62) para produção de proteínas recombinantes in vitro (CFPS), são compostos por materiais biológicos altamente sensíveis a variação de temperatura. O CFPS é uma técnica utilizada para síntese de proteína in vitro. Com essa tecnologia é possível flexibilizar e reduzir o tempo gasto na produção de proteínas tanto em nível de estudo básico como em níveis de estudos aplicados e recentemente foi usada em escala de produção industrial. Através do CFPS é possível a adição de aminoácidos não canônicos, assim como a biossíntese de toxinas, considerados anteriormente como limitações no processo baseado em expressão por organismos vivos. Extratos celulares preparados para CFPS são comumente armazenados a -20°C ou -80°C antes do uso a fim de manter a viabilidade da síntese de proteínas. Isso exige um investimento de capital considerável na forma de freezers de temperatura baixa ou ultrabaixa, sua manutenção, congeladores de backup de emergência e energia de backup de emergência. Estas considerações de armazenamento são particularmente complicadas quando se armazenam grandes quantidades de extrato para aplicações comerciais, onde se tem uma larga escala de produção projetada e/ou produção para exportação e envio do material. Uma limitação adicional de armazenar os extratos de CFPS abaixo das temperaturas de congelamento é a incapacidade de transportá-los facilmente para aplicações de uso móvel. Uma possibilidade para melhorar a eficiência e utilidade do armazenamento do extrato CFPS é liofilizar os extratos. A liofilização de soluções proteicas simples é um processo bastante utilizado para remoção de líquidos voláteis, restando apenas um pó de proteína. Esta técnica reduz o volume de armazenamento e diminui a taxa de degradação proteica. Nossa proposta é que a liofilização dos extratos de células de E. coli reduza de forma semelhante o volume de armazenamento e potencialmente permita uma maior vida útil em temperaturas bem acima de -80°C. Sistemas livres de células liofilizados são comercialmente disponíveis, e estudos anteriores relataram a síntese bem-sucedida de várias proteínas usando extratos liofilizados reidratados. Entretanto, um método simples e robusto para produção de um sistema isento de células baseado em E. coli liofilizado ainda não foi detalhado na literatura. Além disso, o impacto da liofilização e seus parâmetros durante o armazenamento a temperaturas não padronizadas sobre o desempenho da síntese proteica ainda não foi descrito. Em nosso projeto, manitol, sacarose, glicose, lactose, trealose e uma combinação destes com diferentes polímeros serão avaliados em concentrações inicialmente de 5% e 10% (p/v) como potenciais excipientes e estabilizadores durante a liofilização dos extratos celulares. Enquanto que sacarose, glicose, lactose e trealose são conhecidos como estabilizadores em formulações liofilizadas de proteína, manitol é utilizado principalmente como um agente de volume. Como o teor de umidade residual das formulações liofilizadas também pode influenciar a estabilidade e sendo um parâmetro importante a ser avaliado. Para determinação da robustez das formulações, diferentes protocolos de liofilização serão realizados em experimentos adicionais. Também nos interessa o impacto do procedimento de annealing durante o processo de liofilização nas propriedades físico-químicas e térmicas das formulações dos extratos celulares, principalmente no que diz respeito à cristalização do manitol. Finalmente, a relação entre propriedades das formulações liofilizadas e sua morfologia também serão avaliadas. A Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) será utilizada para caracterização morfológica. Adicionalmente, e se este for o caso, o grau de cristalização do manitol será determinado através da técnica de Difração de Raios-X (DRX). (AU)