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Análise transcricional de genes marcadores osteogênicos e adipogênicos em células do ligamento periodontal humano com alto e baixo potencial osteogênico

Processo: 20/05102-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de setembro de 2020
Vigência (Término): 31 de agosto de 2021
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Odontologia - Periodontia
Pesquisador responsável:Denise Carleto Andia
Beneficiário:Ana Carolina Bontempi
Instituição-sede: Vice-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa. Universidade Paulista (UNIP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Cultura de células   Adipogenia   Cromatina   Células-tronco mesenquimais   Regulação da expressão gênica   Processos biológicos   Reação em cadeia da polimerase em tempo real   Citometria de fluxo   Técnicas in vitro   Estudo comparativo

Resumo

As células mesenquimais do ligamento periodontal de humanos (PDLCs) demonstram potencial de diferenciação em algumas linhagens e são candidatas a terapias regenerativas. Recentemente, nosso grupo de pesquisa caracterizou PDLCs com diferentes potenciais osteogênicos, ou seja, com alta (h-PDLCs) ou baixa (l-PDLCs) capacidade de formação de nódulos minerais in vitro. Essas PDLCs foram submetidas ao Assay for Transposase Accessible Chromatin, seguido de sequenciamento de próxima geração (ATAC-Seq) e análises de Bioinformática (FAPESP/University of Birmingham - 2017/07944-5), com o objetivo de identificar regiões acessíveis da cromatina e, portanto, potencialmente ativas e regulatórias. Interessantemente, mesmo no nível basal (sem nenhum estímulo à diferenciação) essas PDLCs já demonstram diferenças em vários quesitos analisados, com destaque para as análises dos superenhancers e suas vias de sinalização e processos biológicos. As análises iniciais apontam para a adipogênese como sendo a via ativa nas l-PDLCs, enquanto nas h-PDLCs, as vias ativadas são as osteogênicas. Estes resultados serviram como base para o desenvolvimento deste projeto de IC, que tem como objetivo confirmar os achados do ATAC-Seq a nível transcricional, ou seja, confirmar se as regiões regulatórias encontradas estão funcionalmente ativas e se traduzem em transcritos gênicos, confirmando, não só o perfil regulatório distinto entre as PDLCs, mas também o perfil transcricional distinto. As PDLCs serão obtidas de terceiros molares de pacientes entre 18 e 20 anos e caracterizadas quanto à sua indiferenciação (presença/ausência de marcadores CD105, CD166, CD34 e CD45, por citometria de fluxo), potencial osteogênico (Vermelho de Alizarina - 21 dias de indução à osteogênese) e adipogênico (Oil Red O - 25 dias de indução à adipogênese) distintos. As células serão coletadas após 10 dias em cultura e o RNA será extraído pelo método do TRIzol. Os níveis dos transcritos de marcadores adipogênicos (PPAR-gama, CEBPD/B/A e KLF15) e osteogênicos (CTNNB1, WNT10a e Colágeno tipo 1), apontados pelo ATAC-Seq, serão avaliados por PCR em tempo real, utilizando-se como gene referência o mais estável (GAPDH, B-ACTIN ou 16S). Os cálculos dos resultados serão realizados pelo método comparativo do ””CT.