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Geração de células epiteliais da glândula mamária knockout para o gene STK3 por tecnologia CRISPR/Cas9

Processo: 20/14844-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de fevereiro de 2021
Vigência (Término): 31 de julho de 2021
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Morfologia - Citologia e Biologia Celular
Pesquisador responsável:Alexandre Bruni Cardoso
Beneficiário:Bruna Cibele Sousa Oliveira
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Citologia   Proteína 9 associada à CRISPR   Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas   Transdução de sinais   Proliferação celular   CRISPR-Cas9

Resumo

A via Hippo é supressora tumoral e está relacionada com a regulação de proliferação celular, apoptose, tamanho de órgãos e tumorigênese. Em mamíferos, o cerne da via Hippo é composto por 4 quinases do tipo serina-treonina: Mammalian Ste-20-like Kinase 1 e 2 (MST1 e MST2) e large tumor supressor 1 e 2 (LATS1 e LATS2). Quando Hippo é ativada, os co-ativadores de transcrição YAP e TAZ são fosforilados e retidos no citoplasma, entretanto, quando a via está inativa, YAP/TAZ não são fosforilados e adentram o núcleo celular, onde ativam fatores de transcrição, aumentando a proliferação e induzindo fenótipo maligno em células epiteliais. Resultados preliminares do nosso laboratório mostraram que em células malignas (T4-2), o mRNA de STK3 (gene que codifica MST2) é mais curto, resultado de splicing do tipo exon skipping que exclui o exon 7 do transcrito (STK3 ”exon7). Análises de dados de RNAseq do The Cancer Genome Atlas (TCGA) revelaram que a variante STK3 ”exon7 também é encontrada em amostras de pacientes com câncer de mama. Com a ausência do exon 7, o transcrito é traduzido em uma proteína que apresenta maior susceptibilidade à degradação. Neste projeto, nós propomos realizar o knockout (KO) do gene STK3 em células epiteliais não tumorais da glândula mamária humana com o uso do sistema CRISPR/Cas9. O modelo celular gerado servirá de base para o desenvolvimento de experimentos para elucidar os efeitos fenotípicos decorrentes da expressão de e MST2 ”exon7 e do reestabelecimento da expressão de MST2 em diferentes concentrações.