Geração de linhagens de T. cruzi (cepa CL Brener) nocautes (KO) para IP6K e avaliação da capacidade de reparo por recombinação homóloga (HR)

• Processo: 20/16480-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Vigência (Início): 01 de março de 2021
• Vigência (Término): 31 de julho de 2023
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Marcelo Santos da Silva
• Beneficiário: Bryan Etindi Abuchery
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IBB). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 19/10753-2 - Investigação do papel dos pirofosfatos de inositol (PP-IPs) em vias de reparo de DNA e dinâmica dos telômeros utilizando tripanossomatídeos como modelo, AP.JP
• Bolsa(s) vinculada(s): 22/04595-8 - Aplicação do método baseado em CRISPR/Cas9-riboswitch para regular negativamente a expressão da quinase inositol polifosfato (IP6K) em Trypanosoma cruzi, BE.EP.MS
• Assunto(s): Proteína 9 associada à CRISPR Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas Recombinação homóloga Reparo do DNA Trypanosoma cruzi
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cas9 | Crispr | Inositol pirofosfatos | Recombinação Homóloga | reparo de DNA | tripanosomatídeos | Trypanosoma cruzi | Biologia Celular e Molecular de tripanosomatídeos

Resumo

Em eucariotos modelo, pirofosfatos de inositol (PP-IPs) - principalmente PP-IP4, IP7 e IP8 - estão envolvidos em uma ampla gama de processos celulares, como regulação do comprimento dos telômeros e recombinação homóloga (HR). No entanto, o mecanismo de ação dos PP-IPs nas vias relacionadas ao metabolismo do DNA (sobretudo na via de reparo por recombinação homóloga - HR) não é totalmente compreendido. PP-IP4, IP7 e IP8 são sintetizados através de vias complementares que envolvem a participação das quinases IP6K e PP-IP5K. Tripanossomatídeos possuem um gene ortólogo para IP6K, mas aparentemente não possuem ortólogos para PP-IP5K, i.e., não sintetizam IP8, o que os torna excelentes modelos para o estudo de PP-IP4 e IP7. Assim, este plano de pesquisa de mestrado consiste em gerar linhagens de T. cruzi (cepa CL Brener) KO para IP6K utilizando o sistema CRISPR/Cas9, desafiar a linhagem gerada com radiação ionizante (IR) e avaliar a capacidade de reparo por HR comparativamente à linhagem WT utilizando citometria de fluxo, curvas de crescimento e cinética de recrutamento proteico (western blot - WB e imunofluorescência - IFA). Resumidamente, a análise do conteúdo de DNA por citometria de fluxo será feita para identificar possíveis paradas do ciclo celular e para medir o período requerido para superá-la. As curvas de crescimento serão realizadas para observar o padrão de proliferação após IR, e a cinética de recrutamento comparativa poderá identificar diferenças sutis no padrão de recrutamento de componentes chaves da via de HR. Vale ressaltar que essa abordagem será de fundamental importância para responder às questões essenciais levantadas pelo projeto principal. (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

ABUCHERY, BRYAN E.; BLACK, JENNIFER A.; DA SILVA, MARCELO S.. Spotlight transcriptomics reveals hidden information in trypanosomatids. Trends in Parasitology, v. 38, n. 1, p. 3-pg., 2021-12-15. (20/01883-7, 20/16480-5, 20/10277-3, 19/10753-2)

ASSIS, LUIZ H. C.; ANDRADE-SILVA, DEBORA; SHIBURAH, MARK E.; DE OLIVEIRA, BEATRIZ C. D.; PAIVA, STEPHANY C.; ABUCHERY, BRYAN E.; FERRI, YETE G.; FONTES, VERONICA S.; DE OLIVEIRA, LEILANE S.; DA SILVA, MARCELO S.; et al. Cell Cycle, Telomeres, and Telomerase in Leishmania spp.: What Do We Know So Far?. CELLS, v. 10, n. 11, NOV 2021. (19/10753-2, 20/08162-3, 21/04253-7, 20/00316-1, 20/16465-6, 18/04375-2, 21/05523-8, 20/10277-3, 19/25985-6, 20/16480-5)

Publicações acadêmicas

(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)

ABUCHERY, Bryan Etindi. Geração de circulas de T. cruzi knock-out para IP6K e avaliação dos fenótipos resultantes. 2023. Dissertação de Mestrado - Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Biociências. Botucatu Botucatu.