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Geração de linhagens de T. cruzi (cepa CL Brener) nocautes (KO) para IP6K e avaliação da capacidade de reparo por recombinação homóloga (HR)

Processo: 20/16480-5
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de março de 2021
Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2023
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
Pesquisador responsável:Marcelo Santos da Silva
Beneficiário:Bryan Etindi Abuchery
Instituição-sede: Instituto de Biociências (IBB). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:19/10753-2 - Investigação do papel dos pirofosfatos de inositol (PP-IPs) em vias de reparo de DNA e dinâmica dos telômeros utilizando tripanossomatídeos como modelo, AP.JP
Assunto(s):Proteína 9 associada à CRISPR   Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas   Recombinação homóloga   Reparo do DNA   Trypanosoma cruzi

Resumo

Em eucariotos modelo, pirofosfatos de inositol (PP-IPs) - principalmente PP-IP4, IP7 e IP8 - estão envolvidos em uma ampla gama de processos celulares, como regulação do comprimento dos telômeros e recombinação homóloga (HR). No entanto, o mecanismo de ação dos PP-IPs nas vias relacionadas ao metabolismo do DNA (sobretudo na via de reparo por recombinação homóloga - HR) não é totalmente compreendido. PP-IP4, IP7 e IP8 são sintetizados através de vias complementares que envolvem a participação das quinases IP6K e PP-IP5K. Tripanossomatídeos possuem um gene ortólogo para IP6K, mas aparentemente não possuem ortólogos para PP-IP5K, i.e., não sintetizam IP8, o que os torna excelentes modelos para o estudo de PP-IP4 e IP7. Assim, este plano de pesquisa de mestrado consiste em gerar linhagens de T. cruzi (cepa CL Brener) KO para IP6K utilizando o sistema CRISPR/Cas9, desafiar a linhagem gerada com radiação ionizante (IR) e avaliar a capacidade de reparo por HR comparativamente à linhagem WT utilizando citometria de fluxo, curvas de crescimento e cinética de recrutamento proteico (western blot - WB e imunofluorescência - IFA). Resumidamente, a análise do conteúdo de DNA por citometria de fluxo será feita para identificar possíveis paradas do ciclo celular e para medir o período requerido para superá-la. As curvas de crescimento serão realizadas para observar o padrão de proliferação após IR, e a cinética de recrutamento comparativa poderá identificar diferenças sutis no padrão de recrutamento de componentes chaves da via de HR. Vale ressaltar que essa abordagem será de fundamental importância para responder às questões essenciais levantadas pelo projeto principal. (AU)