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Regulação do metabolismo energético por transporte de cálcio no fígado

Processo: 21/02481-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de abril de 2021
Vigência (Término): 31 de março de 2023
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Metabolismo e Bioenergética
Pesquisador responsável:Alicia Juliana Kowaltowski
Beneficiário:Eloisa Aparecida Vilas Boas
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:20/06970-5 - Transportadores iônicos mitocondriais como sensores e reguladores do metabolismo energético, AP.TEM
Assunto(s):Cálcio   Fígado   Metabolismo   Mitocôndrias

Resumo

Piruvato, isocitrato e a a-cetoglutarato desidrogenases da matriz mitocondrial mostraram ter atividades aumentadas na presença de íons Ca2+ in vitro (Denton e McCormack, 1985; Hansford, 1985). No entanto, esses estudos foram conduzidos modulando a atividade enzimática isolada e mostram aumentos na afinidade do substrato, mas não na velocidade máxima. Além disso, os efeitos dessas atividades enzimáticas no fluxo global da via metabólica mitocondrial não foram determinados. Assim, propomos verificar se a fosforilação oxidativa suportada por diferentes substratos (piruvato, isocitrato, malato, a-cetoglutarato, glutamato, palmitoil-CoA e fosfato de glicerol) é modulada por Ca2+ em mitocôndrias isoladas intactas. Isso será testado em mitocôndrias hepáticas isoladas, uma vez que ocorre neste tecido uma rica regulação metabólica pelo Ca2+. Além disso, a homeostase do Ca2+ mitocondrial do fígado é alterada pela dieta (Menezes-Filho et al., 2017; Menezes-Filho et al., 2019). O Ca2+ extramitocondrial será adicionado em diferentes concentrações, com ou sem inibição do uniporter de cálcio mitocondrial (MCU) pelo vermelho de rutênio, para modular o Ca2+ extra e intramitocondrial. O Ca2 na matriz também será removida por incubação com BAPTA AM. Os efeitos sobre o consumo de oxigênio, relações ADP/O e medições calibradas do potencial da membrana mitocondrial interna (Kowaltowski et al., 2002) serão monitorados. Esses experimentos determinarão se o Ca2+ extra ou intramitocondrial modula a fosforilação oxidativa suportada por diferentes substratos, o que surpreendentemente não foi verificado até o momento.As taxas respiratórias também serão determinadas pela análise Seahorse Extracellular Flux (Cerqueira et al., 2016; Chausse et al., 2019) em linhas de células de hepatócitos na presença e ausência de atividades MCU e NCLX, para determinar o papel do transporte mitocondrial de Ca2+ em fosforilação oxidativa in vivo. As células incubadas com BAPTA-AM, tapsigargina ou ionomicina serão utilizadas como controles para baixo e alto Ca2+ intracelular.Além de possivelmente regular as atividades específicas da via metabólica mitocondrial, a captação mitocondrial de Ca2+ altera a dinâmica do Ca2+ citosólico e, portanto, também pode influenciar as vias metabólicas citosólicas. Assim, investigaremos a influência do transporte mitocondrial de Ca2+ na atividade metabólica celular global, verificando os efeitos da inibição de MCU ou NCLX no metabolismo celular. Inibidores de ER SERCA e store operated Ca2+ entry (Rahman e Rahman, 2017), bem como quelação de Ca2+ intracelular com BAPTA-AM, serão usados para comparação dos efeitos de outros sistemas de transporte de Ca2+. As taxas relativas de oxidação de lipídios, glicose e glutamina serão determinadas por análise de Seahorse Extracellular Flux na presença desses substratos e inibidores das vias metabólicas (Pike Winer e Wu, 2014). Os resultados serão corroborados por medições dos níveis de fosforilação das principais enzimas regulatórias metabólicas (incluindo fosfofrutocinase / frutose bifosfatase 1 e 2, acetil CoA carboxilase, piruvato quinase, glicogênio fosforilase, glicogênio fosforilase quinase) e medições de NAD(P)+/NAD(P)H nas mitocôndrias e no citosol. Lactato, glutamato e principais espécies de lipídeos também serão quantificados. Isso será realizado em colaboração com o Prof. Sayuri Miyamoto, já um colaborador estabelecido em nossos estudos metabólicos (Menezes-Filho et al., 2017; Chausse et al., 2019).Cerqueira et al. 2016 FEBS J 283:822-833.Chausse et al., 2019 Biosci Rep 39: BSR20190072.Kowaltowski et al 2002 J Biol Chem 277:42802-42807.Menezes-Filho et al 2017 Free Radic Biol Med. 110:219-227.Menezes-Filho et al 2019 Biochim Biophys Acta Bioenerg 1860:129-135.Pike Winer and Wu, 2014 PLoS One 9:e109916.Rahman and Rahman 2017 Sci Rep 7:12881. (AU)