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Produção de agentes de captura de proteínas ubiquitinadas para estudo no contexto da transição epitelio-mesenquimal

Processo: 21/03575-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de agosto de 2021
Vigência (Término): 31 de julho de 2022
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
Pesquisador responsável:Vitor Marcel Faça
Beneficiário:Izadora Archiolli
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Proteômica   Anticorpos   Ubiquitinação   Transição epitélio-mesenquimal

Resumo

O câncer é um conjunto de doenças multifatoriais que geram o crescimento desordenado das células, formando tumores malignos e podendo invadir tecidos adjacentes ou órgãos distantes, pelo processo de metástase, sendo esse último o responsável pela letalidade da doença. Um dos mecanismos moleculares que ocorre durante a metástase é a transição epitelial-mesenquimal (EMT). A EMT é controlada por múltiplos fatores que disparam a capacidade das células de se desprenderem de uma massa tumoral primária, cair na circulação e criar sítios secundários da doença. Alguns estudos indicam que a modificação pós-traducional de proteínas do tipo ubiquitinação está intimamente relacionada a EMT, favorecendo ou impedindo a progressão tumoral. Por tudo isso, pretendemos utilizar uma estratégia de captura específica de proteínas ubiquitinadas através da produção de um anticorpo para purificação por imunoafinidade. Iremos sintetizar o peptídeo com 13 aminoácidos ESTLHLVLRLRGG, que representa a cauda C-terminal da ubiquitina e utilizá-lo como antígeno para obter inicialmente anticorpos policlonais e também anticorpos sintéticos obtidos pela tecnologia de "phage-display". Estes agentes de afinidade serão utilizados para explorar dois modelos celulares in vitro da EMT, provenientes de adenocarcinoma de glândula mamária e ovário. Os modelos celulares serão induzidos ao processo de EMT, com acompanhamento dos biomarcadores do processo por ensaios de western blotting e ensaios funcionais de migração celular. Proteínas extraídas desses modelos passarão pela etapa de isolamento dos alvos ubiquitinados por imunoafinidade e, por fim, submetidas a uma análise proteômica de larga escala e também de proteômica dirigida usando a técnica de monitoramento de reações múltiplas. Com isso será possível identificar proteínas diferencialmente envolvidas no processo de EMT e eventualmente as enzimas específicas que controlam tal ubiquitinação. Este estudo pode revelar novos alvos para detecção da progressão tumoral e potencialmente novos alvos para inibição farmacológica da EMT ou para a progressão tumoral.