Melhoramento da rota de produção de etanol por bactérias termofílicas a partir do engenheiramento da ferredoxina: expressão heteróloga e avaliação in vitro

• Processo: 21/10838-8
• Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
• Vigência (Início): 01 de outubro de 2021
• Vigência (Término): 30 de abril de 2025
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
• Pesquisador responsável: Daniel Groban Olson
• Beneficiário: Layse Costa de Souza
• Instituição-sede: Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 18/25682-0 - Laboratório de biocombustíveis avançados de segunda geração, AP.SPEC
• Assunto(s): Biotecnologia Bioengenharia Etanol Clostridium thermocellum Ferredoxinas Expressão heteróloga Técnicas in vitro Voltametria cíclica

Resumo

É amplamente reconhecido que compreender e manipular o metabolismo redox é fundamental para a Engenharia Metabólica destinada a alcançar altos títulos e rendimentos e, na verdade, muitas vezes mais importante do que a manipulação do metabolismo do carbono. A ferredoxina é uma proteína central no metabolismo do etanol em C. thermocellum, onde atua como aceptora de elétrons para PFOR, bem como doadora de elétrons para a redução de NADH (através de RNF), que é posteriormente utilizado na redução de acetil- CoA para etanol. As propriedades eletrônicas e estruturais da ferredoxina influenciam a rede de fluxo metabólico de duas maneiras: 1) a taxa de transferência de elétrons nas reações dependentes da ferredoxina é parcialmente governada pela geometria e especificidade das interações proteína-proteína transitória (PPIs) formada entre a ferredoxina e suas enzimas parceiras; 2) o potencial E0 da ferredoxina desempenha um papel no estabelecimento da força motriz termodinâmica (G) para uma determinada reação, que por sua vez afeta a quantidade de enzima necessária para sustentar um fluxo desejado. Apesar desse papel central, a ferredoxina é provavelmente o portador de elétrons menos compreendido em C. thermocellum. Além disso, sendo uma proteína, também é distinta entre os portadores de elétrons por ser passível de Engenharia de Proteínas, permitindo-nos modificar suas propriedades estruturais e eletrônicas para otimizar o fluxo de elétrons em direção ao etanol. É, então, proposta uma abordagem combinada de Engenharia Bioquímica e Engenharia de Proteína com o objetivo de compreender e manipular a ferredoxina para melhorar a produção de etanol. Na abordagem bioquímica, haverá a purificação e caracterização da ferredoxina de C. thermocellum e T. saccharolyticum. Os potenciais E0 serão determinados por meio de voltametria cíclica realizada em ferredoxina imobilizada em uma célula eletroquímica. Esses resultados, quando combinados com resultados de experimentos metabolômicos, permitirão determinar o ”G para as reações de transferência de elétrons relevantes, a fim de prever quantitativamente modificações no potencial de ponto médio da ferredoxina que poderiam melhorar o fluxo de etanol. A segunda abordagem é, a partir de resultados de Engenharia de Proteínas, gerar duas bibliotecas de ferredoxinas mutantes: uma com E0 alterado por mutação de aminoácidos nos domínios de ligação de aglomerados de ferro-enxofre conservados e outra com PPIs alterados por mutação de aminoácidos na superfície e avaliar seu efeito no rendimento do etanol. Uma vez que ainda não é possível prever essas propriedades da sequência primária, será inicialmente desenvolvida uma modesta biblioteca em E. coli com base na literatura anterior e será caracterizado o potencial E0 conforme descrito acima. Um pequeno subconjunto desses mutantes com E0's abrangendo o intervalo identificado a partir das previsões na primeira abordagem será então transformado em C. thermocellum e os resultados da fermentação serão analisados. Para a biblioteca com PPIs alterados, os candidatos serão inicialmente testados em ensaios in vitro com PFOR e RNF para identificar um subconjunto de mutantes que melhoram a atividade. Estes serão, então, transformados em C. thermocellum para avaliar o impacto na produção de etanol. O benefício dessa abordagem é que ela se baseia na modificação de uma única pequena proteína para melhorar a eficiência do fluxo de elétrons para o etanol, em vez de superexpressar grandes enzimas metabólicas, que podem impor uma carga metabólica adicional à célula. (AU)