Avaliação de técnicas para inserção de ácidos nucleicos em plasmócitos

• Processo: 22/00862-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de fevereiro de 2022
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2022
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Imunologia - Imunologia Celular
• Pesquisador responsável: Gerson Dierley Keppeke
• Beneficiário: Kethellen Graziele Gomes da Silva
• Instituição Sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 17/20745-1 - Depleção de autoanticorpos por edição gênica com o sistema CRISPR/Cas9 em plasmócitos autorreativos, AP.JP
• Assunto(s): Reumatologia Edição de RNA Transfecção Ácidos nucleicos Plasmócitos Toxicidade de drogas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: edição gênica | PBMCs | Plasmídeo | transfecção | Reumatologia

Resumo

A inserção de ácidos nucleicos tais como plasmídeos de DNA ou fragmentos de RNA, visando à edição genômica, em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) aos quais se incluem os plamócitos, é uma tarefa difícil, principalmente devido à baixa eficiência. Vários métodos estão disponíveis comercialmente, portanto o objetivo deste trabalho será testar os diferentes métodos de inserção de ácidos nucleicos em plamócitos, para encontrar o mais eficiente e com menor toxicidade. Plamócitos totais isolados com microbeads magnéticas a partir do PBMC de três doadores saudáveis serão cultivados e submetidos à transfecção por partículas lipídicas contendo um plasmídeo circular de DNA. O mesmo plasmídeo de DNA também será inserido utilizando eletroporação. Num terceiro grupo, o gene desejado será inserido nos plamócitos utilizando partículas virais carregadoras, mais precisamente lentivírus. O plasmídeo ou lentivírus deverá conter pelo menos um gene capaz de produzir uma proteína fluorescente na cor verde, como GFP. A observação dos plasmócitos transfectados ou transduzidos no microscópio de fluorescência permitirá estimar proporcionalmente a eficiência do método de inserção de material genético. A toxicidade do procedimento será avaliada pela incorporação de Iodeto de Propídeo, marcador na cor vermelha que indica a desestabilização da membrana plasmática, ou seja, células em processo de morte. Esperamos neste trabalho identificar o melhor método para inserção nos plamócitos dos genes da Cas9 e dos RNAs guia para execução de técnicas de edição genômica nestas células.(AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

GOMES, K.; AIRES, P. P.; KEPPEKE, G. D.. Evaluation of commercially available chemical reagents and electroporation for insertion of nucleic acids into hard-to-transfect cells. Genetics and Molecular Research, v. 22, n. 2, p. 10-pg., 2023-06-02. (17/20745-1, 22/00862-1)