Caracterização bioquímica das E3 ubiquitina-ligases do tipo CRL (Cullin RING-ligases) em Leishmania infantum

• Processo: 21/10971-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2022
• Situação: Interrompido
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Felipe Roberti Teixeira
• Beneficiário: Camila Rolemberg Santana Travaglini Berti de Correia
• Instituição Sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
• Bolsa(s) vinculada(s): 23/07201-3 - Caracterização funcional dos ligantes das proteínas SKP1 e CUL1 de Leishmania infantum por bar-seq/CRISPR-Cas9, BE.EP.DD
• Assunto(s): Parasitologia molecular Leishmania infantum CRISPR-Cas9 Ubiquitina-proteína ligases Via da ubiquitina-proteassoma Propriedades bioquímicas Imunoprecipitação Interação proteína-proteína Ubiquitinação Interações hospedeiro-parasita Leishmaniose Espectrometria de massas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: CRISPR-Cas9 | leishmania infantum | Sistema Ubiquitina-Proteassoma | Parasitologia molecular

Resumo

O Sistema Ubiquitina-Proteassoma (SUP) é o principal responsável pela proteólise intracelular em eucariotos, sendo composto por três enzimas: E1 (enzima ativadora de ubiquitina), E2 (enzima carreadora de ubiquitina) e as E3 (enzima ubiquitina-ligase) que exercem papel chave neste processo, reconhecendo e transferindo ubiquitina para o substrato proteico que poderá ser destinado a degradação pelo proteassoma. Em protozoários parasitas, a proteólise intracelular é essencial para a alternância de hospedeiros em seus ciclos de vida e consequentemente para o sucesso do parasitismo. Nos parasitos do gênero Leishmania, o SUP é fundamental para o seu ciclo de vida e proliferação sendo alvo farmacológico para o tratamento de Leishmanioses, grupo de doenças negligenciadas que afetam milhões de pessoas no mundo. Entretanto, apesar da relevância do SUP para Leishmania não existem estudos de caracterização de E3 ubiquitina-ligases nestes parasitos. Neste projeto, propomos caracterizar bioquimicamente os genes de L. infantum LINF_110018100, LINF_210005300 e LINF_240029100 que são ortólogos aos genes humanos SKP1, RBX1 e CUL1 respectivamente, que são parte da maior e mais bem estudada classe de E3 ligases em humanos chamada Cullin RING ligases (CRLs). Para isso, parasitos de L. infantum serão geneticamente modificados por meio da estratégia CRISPR-Cas9 para inserção de tags 3xmyc-mCherry nestes genes. Realizaremos a caracterização bioquímica destas linhagens através da identificação dos ligantes das proteínas codificadas por estes genes através de imunoprecipitação das proteínas em fusão com myc tag, seguido de análise por espectrometria de massas para identificação dos ligantes. Buscaremos no interactoma das proteínas SKP, Cullin e RBX de L. infantum os potenciais componentes das CRLs deste parasito. Por fim, ensaios de validação de interação proteína-proteína e ubiquitinação in vitro e in vivo serão realizados. Assim, os resultados deste projeto contribuirão para o conhecimento da fisiologia deste parasito e a sua relação com o hospedeiro, podendo levar a identificação de novos alvos para intervenção farmacológica visando o tratamento das Leishmanioses. (AU)