Investigação funcional de novos reguladores da fagocitose associada a LC3 (LAP) e autofagia não canônica em macrófagos

• Processo: 22/08177-6
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 16 de novembro de 2022
• Data de Término da vigência: 03 de novembro de 2023
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Imunologia - Imunologia Celular
• Pesquisador responsável: Larissa Dias da Cunha
• Beneficiário: Edismauro Garcia Freitas Filho
• Supervisor: Oliver Florey
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Babraham Institute, Inglaterra
• Vinculado à bolsa: 19/26040-5 - Identificação e caracterização de novos determinantes moleculares da fagocitose associada a LC3 (LAP) em macrófagos, BP.PD
• Assunto(s): Imunidade inata Fagocitose Autofagia Macrófagos Fagossomos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: early endosomal trafficking | Innate immunity | LAP and CASM | phagosome maturation | Rab5c | Imunidade Inata

Resumo

A via de autofagia não canônica conhecida como fagocitose associada a LC3 (LAP) é um processo celular chave que regula a resposta de células da imunidade inata, controlando o balanço da inflamação e das respostas inatas que promovem a proteção e o reparo tecidual. LAP, um dos eventos CASM (Conjugation of ATG8 to Endolysosomal Single Membranes), utiliza-se de alguns componentes, mas não todos, da maquinaria da macroautofagia para induzir uma conjugação alternativa do LC3 à membrana dos fagossomos que por fim resultará na degradação da molécula cargo. Nesse contexto, LAP conduz a integração entre a fagocitose de partículas imuno-estimulatórias com a modulação da expressão gênica e a polarização funcional dos macrófagos. Embora diversos constituintes da cascata de LAP tenham sido reportados, os mecanismos subjacentes à fina organização da montagem dos complexos de LAP e de seus componentes moduladores permanecem pouco compreendidos. Portanto, esse estudo objetiva determinar como os novos componentes de LAP, que foram recentemente identificados durante o meu projeto de pós-doutorado, regulam essa via. Inicialmente, hipotetizando que o tráfego endosomal pode atuar como um eixo central no direcionamento/organização das proteínas da cascata de LAP para os fagossomos, nós observamos pela primeira vez um papel positivo e específico para a RAB5c GTPase durante LAP. Apenas a ablação da isoforma c de RAB5, mas não das isoformas a ou b, resultou na redução da lipidação de LC3 à membrana dos fagossomos em macrófagos estimulados via LAP. Ainda, nós também estabelecemos o perfil do interatoma de RUBCN, um componente crítico de LAP. Caracterizamos o interactoma de RUBCN empregando uma estratégia de marcação de biotinilação heteróloga por proximidade com as proteínas alvos. Nossa proteômica imparcial identificou 202 alvos de ligação à RUBCN, dos quais selecionamos alguns candidatos e estamos atualmente determinando os seus impactos na via de LAP. Esses candidatos estão envolvidos em diversos processos imunes e ainda associados à fagocitose de macrófagos e às etapas iniciais e finais da biogênese do fagossomo. Assim, propomos aqui uma colaboração com o Dr. Oliver Florey, pesquisador referência em autofagia não canônica e CASM, com foco em: 1) investigar o tráfego de Rab5c para o fagossomo e como o tráfego endossomal precoce mediado por Rab5c contribui para LAP; e 2) caracterizar o papel de alvos promissores na organização dos complexos moleculares de LAP e nas vias de sinalização responsáveis pela maturação do LAPossoma. Com esse intuito, nós utilizaremos em associação às abordagens moleculares e bioquímicas as avançadas análises de microscopia em tempo real fornecidas pelo Babraham Institute, como a microscopia confocal de spinning-disk, a super-resolução quadridimensional e a microscopia eletrônica de vídeo-luz. Nossos achados poderão revelar novos alvos farmacológicos capazes de induzir ou bloquear LAP e ajudar a elucidar como e por que LAP diverge da macroautofagia e outros eventos CASM, fornecendo uma importante ferramenta para a investigação da resposta imune em patologias que LAP participa. (AU)