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Uso de CRISPR para marcar o lncRNA RMEL3 endógeno para estudo de suas interações moleculares e localização subcelular

Processo: 22/09764-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de outubro de 2022
Vigência (Término): 30 de setembro de 2023
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Enilza Maria Espreafico
Beneficiário:Vitor Merino Loes
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:13/08135-2 - CTC - Centro de Terapia Celular, AP.CEPID
Assunto(s):Proteína 9 associada à CRISPR   Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas   MAPK   Melanoma   Biologia tumoral

Resumo

RNAs longos não codificantes (lncRNA) constituem uma classe de RNAs com atuação na regulação da expressão gênica e sinalização celular. Diversos lncRNAs desempenham funções no câncer e um deles, RMEL3 (Restricted to Melanoma 3), foi identificado pelo nosso laboratório em melanoma, um câncer originário de melanócitos, células pigmentares da pele. O RMEL3 é superexpresso em melanomas portadores da mutação BRAFV600E e sua expressão é dependente da atividade desta quinase. BRAF, primeira quinase da cascata de sinalização das MAPK, é desregulada na maioria dos cânceres. Dados prévios mostram que o silenciamento do RMEL3 reduz a viabilidade de células BRAFV600E, enquanto a superexpressão aumenta a taxa de proliferação e viabilidade em condições de privação de mitógenos e o crescimento tumoral em animais experimentais. Essas evidências tornam o RMEL3 um potencial alvo terapêutico. Com o objetivo de caracterizar o mecanismo de ação desse lncRNA, nosso laboratório investiu na realização de ensaios de interação do RMEL3 endógeno com proteínas. Dentre as candidatas identificadas, estão proteínas envolvidas diretamente na via MAPK (ARAF, FAM83D) e na via supressora de tumor de Hippo (STK3/Mst2), entre outras, envolvidas no reparo do DNA, apoptose, citoesqueleto e tradução de mRNA. Logo, os objetivos deste projeto são: i) utilizar algoritmos de modelagem estrutural in silico para obter informações sobre os sítios do RMEL3 envolvidos em interações com proteínas; ii) marcar o lncRNA RMEL3 com a etiqueta de grampos MS2, para validar as interações moleculares identificadas previamente e caracterizar a dinâmica intracelular desse lncRNA em associação com proteínas alvos em células de melanoma. Com este projeto, esperamos contribuir para criação de novas ferramentas moleculares para compreensão do papel desse lncRNA na regulação das vias de sinalização envolvidas na progressão do melanoma.

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