Transporte de cálcio mitocondrial em sinalização de nutrientes: NCLX regula atividade de mTORC1?

• Processo: 22/08581-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
• Vigência (Início): 01 de dezembro de 2022
• Vigência (Término): 30 de novembro de 2023
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Metabolismo e Bioenergética
• Pesquisador responsável: Alicia Juliana Kowaltowski
• Beneficiário: Vitor de Miranda Ramos
• Supervisor: Viktor Korolchuk
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Local de pesquisa: Newcastle University, Inglaterra
• Vinculado à bolsa: 19/18402-4 - Efeitos da regulação do transporte de cálcio mitocondrial sobre o processo autofágico em hepatócitos, BP.DR
• Assunto(s): Metabolismo mitocondrial Alvo mecanístico do complexo 1 de rapamicina Autofagia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: autophagy | mitochondrial calcium | mTORC1 | Nclx | nutrient sensing | mTORC1

Resumo

O metabolismo mitocondrial e a atividade de mTORC1 são centrais na detecção de nutrientes e na coordenação de uma resposta celular adaptativa. De fato, ambas as vias estão interligadas por diferentes intermediários, proporcionando uma regulação recíproca. Dado o papel bem estabelecido das mitocôndrias na modulação de sinais de cálcio intracelular e a clara participação do cálcio na regulação do mTORC1, é racional especular que os íons de cálcio podem ser um dos muitos atores na comunicação entre mitocôndrias e mTORC1. É importante ressaltar que resultados preliminares do nosso grupo mostraram que a inibição farmacológica do efluxo de cálcio mitocondrial previne a inibição de mTORC1 por deprivação de soro e aminoácidos. Assim, o foco deste projeto é avaliar a participação do efluxo mitocondrial de cálcio através do trocador mitocondrial de Ca2+/Li+/Na+ (NCLX) na regulação da atividade do mTORC1. O plano de trabalho para este projeto está dividido em três fases. Primeiro, testaremos diferentes protocolos para modulação da atividade de mTORC1 na presença ou ausência de inibição farmacológica de NCLX. Podemos assim elucidar quais vias de regulação do mTORC1 são mais sensíveis à atividade de NCLX, selecionando as condições para experimentos futuros. Como medida inicial da atividade do mTORC1, analisaremos os níveis de fosforilação de seus alvos canônicos, S6K (T389), S6 (S235/236) ou 4E-BP1 (T37/46), por Western blot (WB). É importante ressaltar que os resultados obtidos serão validados usando knockdown genético (KD) de NCLX por transfecção de small-interference RNA (siRNA). Na segunda fase deste projeto, vamos nos concentrar em investigar o mecanismo pelo qual NCLX pode alterar a atividade mTORC1. Vamos nos concentrar em três fatores principais envolvidos na regulação do mTORC1: (1) recrutamento do mTORC1 para a superfície do lisossomo, (2) recrutamento do complexo TSC para a superfície do lisossomo e (3) posicionamento do lisossomo dentro da célula. Todos esses mecanismos serão investigados por imunofluorescência de mTOR-Lamp1, TSC2-Lamp1 ou Lamp1 isoladamente e avaliados por microscopia confocal e análise de colocalização. Na terceira fase do projeto, pretendemos avaliar as possíveis consequências das vias regulatórias descobertas. Por exemplo, a falta de sensibilidade do mTORC1 à deprivação de nutrientes está associada à senescência celular e doenças relacionadas ao envelhecimento. Assim, pretendemos investigar se a atividade de NCLX também está alterada em células senescentes e como isso pode estar relacionado à disfunção de mTORC1. Para tanto, avaliaremos a expressão e a atividade de NCLX por RT-qPCR medindo o efluxo de cálcio mitocondrial em células intactas usando um modelo de senescência celular induzida por estresse. Se observarmos alterações na atividade de NCLX por senescência, podemos usar ferramentas genéticas para KD ou superexpressar NCLX, investigando assim a relação deste transportador com mTORC1 neste contexto. (AU)