Investigação das relações estrutura-função de desidrogenases ativas sobre aromáticos: desvendando e otimizando mecanismos enzimáticos para produção de vanilina a partir de fontes renováveis

• Processo: 22/01070-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2022
• Situação: Interrompido
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Enzimologia
• Pesquisador responsável: Priscila Oliveira de Giuseppe
• Beneficiário: Anna Julyana Viana Chianca Brilhante
• Instituição Sede: Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM). Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação (Brasil). Campinas , SP, Brasil
• Bolsa(s) vinculada(s): 24/03956-2 - Construção estratégica de uma biblioteca gênica para evolução dirigida/design semi-racional de enzimas: em busca da compreensão do reconhecimento de substratos e da otimização da especificidade enzimática, BE.EP.DR
• Assunto(s): Álcool desidrogenase Aldeído desidrogenase Biologia estrutural Biotransformação Compostos aromáticos Cristalografia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: álcool desidrogenase | Aldeído desidrogenase | Biologia Estrutural | biotransformação | Compostos Aromáticos | Cristalografia | mecanismos enzimáticos

Resumo

A vanilina é uma molécula que figura como o agente flavorizante e aromatizante mais utilizado no mundo. Atualmente, a principal matéria-prima para sua produção é o petróleo. Entretanto, a crescente demanda pela vanilina de origem natural, o apelo pela utilização de fontes renováveis e as desvantagens associadas aos processos convencionais de produção da vanilina tem impulsionado a busca por rotas de produção alternativas. A produção de vanilina a partir de moléculas de origem renovável, tais como o eugenol, é uma das alternativas mais promissoras para a biossíntese de vanilina em escala industrial. Porém, o conhecimento e o desenvolvimento de tecnologias enzimáticas para essa aplicação ainda são incipientes. Em um projeto anterior, nós caracterizamos duas desidrogenases (XarA e XarB) codificadas por um operon em Xanthomonas e que apresentam potencial aplicação na via de bioconversão do eugenol em vanilina. XarA é uma aril álcool desidrogenase com alta especificidade para álcool coniferílico, convertendo-o em coniferaldeído (etapa 2 da via eugenol-a-vanilina) e XarB é uma aldeído desidrogenase que converte coniferaldeído em ácido ferúlico (etapa 3 da via). Embora XarA apresente alta especificidade para álcool coniferílico (~100 vezes maior em relação a outros substratos testados), XarB é menos específica, apresentando constantes de especificidade na mesma ordem de grandeza para os substratos coniferaldeído e vanilina. Se por um lado a baixa seletividade de XarB inviabiliza sua aplicação na via eugenol-a-vanilina, visto que ela também é ativa sobre o produto de interesse, por outro, isso a torna um ótimo modelo de estudo de engenharia racional visando aumentar sua especificidade ao substrato desejado. Considerando que o álcool coniferílico e o coniferaldeído conservam a mesma estrutura, exceto pela diferença de um hidrogênio na cauda alifática, nossa hipótese de trabalho é que conhecendo o mecanismo que confere alta especificidade para a XarA no uso de álcool coniferílico, isso pode nos guiar para otimizar a especificidade de XarB em relação ao coniferaldeído. Entretanto, ainda existem grandes lacunas acerca dos mecanismos moleculares que determinam a especificidade de enzimas com esse tipo de atividade. Ainda não há no Protein Data Bank estruturas de coniferil álcool desidrogenases ou de coniferaldeído desidrogenases disponíveis. Dados bioquímicos sobre a especificidade de enzimas homólogas também são muito escassos. Assim, neste projeto, temos como objetivo desvendar as bases moleculares da especificidade de coniferil álcool desidrogenases e de coniferaldeído desidrogenases combinando enzimologia, cristalografia de raios-X, mutação sítio-dirigida e abordagens de biologia computacional (como dinâmica e docking molecular). Como modelos de estudo usaremos as enzimas XarA e XarB, bem como as enzimas comumente usadas na engenharia de microrganismos para produção de vanilina a partir de eugenol (CalA e CalB de Pseudomonas sp. HR199). Como prova de conceito da aplicação desse conhecimento em estratégias de engenharia racional, iremos usar XarB como arcabolço enzimático e tentar otimizar sua especificidade ao coniferaldeído. Dessa forma, preencheremos, com esse projeto, lacunas de conhecimento acerca dos mecanismos que regem a especificidade de aril-álcool e aril-aldeído desidrogenases e investigaremos a aplicabilidade desse conhecimento na modulação da especificidade de aril-aldeído desidrogenases para aplicações industriais, usando nesse caso, a rota de produção de vanilina a partir de eugenol como exemplo. (AU)