Glico-engenharia de células CHO-DG44 para produção de R-Espondina 1 humana recombinante (rhRSPO1) com alto teor de cadeias de glicanos N-ligados terminalmente sialilados

• Processo: 22/01906-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2022
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Mari Cleide Sogayar
• Beneficiário: Vitor Prado Colantoni
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 16/05311-2 - Medicina regenerativa visando à terapia de doenças crônico-degenerativas (câncer e diabetes), AP.TEM
• Bolsa(s) vinculada(s): 24/00036-0 - Análise do perfil de glicosilação da proteína R-Espondina 1 humana recombinante (rhRSPO1) produzida por células CHO-DG44 glico-engenheiradas, BE.EP.DD
• Assunto(s): Engenharia genética Engenharia de proteínas Biofármacos Polissacarídeos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biologia molecular | engenharia genética | Expressão recombinante de biofármacos | Glicoengenharia de proteínas | Rspo1 | St6Gal1 | Engenharia genética, Glicoengenharia de proteínas, Expressão recombinate de biofármacos

Resumo

As R-Espondinas (RSPOs) compõem uma família de glicoproteínas secretadas conhecidas por seus papéis importantes na proliferação, diferenciação e morte celular, induzindo a via de Wnt. Estudos têm demonstrado a importância das RSPOs na regulação de diversos processos tecido-específicos, em particular, a proliferação de células-tronco intestinais. Visando sua aplicação na regeneração de intestino na síndrome do intestino curto (SIC), que causa sérios problemas de nutrição e desenvolvimento nos pacientes acometidos, nosso grupo estabeleceu plataformas de expressão recombinante da proteína RSPO1 e avaliou a atividade da proteína recombinante (rhRSPO1). Concluiu-se que o tratamento com rhRSPO1 e a consequente ativação da via canônica de Wnt se mostrou bastante promissor para a geração de um intestino murino engenheirado funcional, contribuindo para melhora dos sintomas da SIC. Entretanto, em preparações de rhRSPO1 purificadas, produzidas a partir de uma linhagem de células animais CHO-DG44, foi observada estabilidade reduzida da proteína, impossibilitando seu armazenamento a longo prazo, dificultando seu processo de purificação e sua possível aplicação na clínica. Acredita-se que a principal razão para essa redução de estabilidade seja o perfil de glicosilação alterado da molécula, particularmente, pela falta de sialilação terminal nas células CHO-DG44, o que pode alterar, significativamente, o processo de dobramento e secreção da proteína, além de alterar a farmacocinética e atividade biológica da molécula. A enzima ST6GAL1 (ST6 ²-galactosídeo ±-2,6-sialiltransferase), responsável pela adição de uma molécula de ácido siálico nas extremidades das cadeias de oligossacarídeos N-ligadas durante o processo de glicosilação, não é expressa em células CHO-DG44. Portanto, neste projeto propõe-se o estabelecimento de uma linhagem de células CHO-DG44 capaz de produzir glicoproteínas com cadeias de glicanos N-ligados terminalmente sialiladas para produção da proteína rhRSPO1, através da promoção da expressão ectópica da enzima ST6GAL1 e da proteína RSPO1, em condições cGMP, com o intuito de aumentar a estabilidade da molécula purificada e sua atividade biológica, visando sua futura aplicação em testes clínicos. (AU)