Edição genética em larga escala para o estudo de doenças do neurodesenvolvimento associadas a CREBBP em modelos celulares isogênicos

• Processo: 23/01662-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2023
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2023
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
• Pesquisador responsável: Mariana Moysés Oliveira
• Beneficiário: Mayara Paschalidis
• Instituição Sede: Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa (AFIP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 21/09089-0 - Edição genética em larga escala para o estudo de doenças do neurodesenvolvimento em modelos celulares isogênicos, AP.JP
• Assunto(s): Células-tronco neurais Células-tronco pluripotentes induzidas Diferenciação neuronal
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Células-tronco neurais | Células-tronco Pluripotentes Induzidas | diferenciação neuronal | Doenças do Neurodesenvolvimento | Edição genômica | regulação epigenética | Edição Genética

Resumo

Introdução: Variantes genéticas raras de novo de perda de função (LoF) e de sentido trocado em genes que codificam reguladores da expressão gênica constituem fatores de risco comumente associados às doenças do neurodesenvolvimento (NDD). CREBBP representa um grande modelo dentro dessa classe de genes, uma vez que diversos mecanismos mutacionais atuam na sua associação com NDD. Enquanto a sua haploinsuficiência, seja por microdeleções em 16p13.3 ou mutações de ponto de perda de função, estão associadas à síndrome de Rubinstein-Taybi, microduplicações em 16p13.3 e variantes missense em um domínio específico da proteína, em ZNF, estão relacionadas à síndrome Menke-Hennekam. Dessa forma, acredita-se que essas últimas variantes atuem por um mecanismo de ganho de função (GoF). Objetivos: Estabelecimento de modelos isogênicos de células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSC) com variantes LoF e de missense em CREBBP no domínio ZNF e avaliação das consequências funcionais da introdução destas variantes, bem como avaliação da eficiência das metodologias utilizadas para a edição genética. Métodos: A metodologia de engenharia genômica CRISPR-Cas9 será utilizada para a introdução das variantes usando dois gRNAs para gerar deleção gênica e, dessa forma, um modelo bona fide de LoF, e Prime Editing para gerar variantes missense específicas de pacientes. Esses modelos serão diferenciados em neurônios corticais glutamatérgicos e avaliados por RNA-seq. Resultados esperados: A avaliação das consequências funcionais permitirá a identificação de discrepâncias entre os fenótipos celulares resultantes das variantes introduzidas. Assim, é esperado que a variante LoF produza fenótipo celular associado à haploinsuficiência do gene CREBBP e que a variante de sentido trocado produza fenótipo celular associado ao GoF do gene. Impactos funcionais de LoF e GoF devem gerar um fenótipo em espelho, ou seja, com fold change em direções opostas quando comparados ao genótipo wild-type. A avaliação da eficiência das metodologias de edição genética utilizadas possibilitará a confirmação de maior eficiência atrelada à metodologia de Prime Editing, utilizada para a variante de sentido trocado, em comparação com a de CRISPR/Cas9, relacionada à edição da variante LoF.