Genes de Leishmania infantum ortólogos aos humanos SKP, CUL1 e RBX são capazes de expressar e montar complexos E3 ubiquitina-ligase do tipo CRL 1 (Cullin 1 RING-ligase) em células humanas?

• Processo: 22/15983-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2023
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 2024
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Felipe Roberti Teixeira
• Beneficiário: Giovana Maffei Rodriguez
• Instituição Sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
• Assunto(s): Leishmania infantum Via da ubiquitina-proteassoma
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cullin RING-ligases | leishmania infantum | Sistema Ubiquitina-Proteassoma | Sistema Ubiquitina Proteassoma

Resumo

O sistema ubiquitina proteassoma (SUP) é o principal responsável pela proteólise intracelular em eucariotos, sendo constituído por 3 enzimas: a E1 (enzima ativadora de ubiquitina), as E2 (enzima carreadora de ubiquitina) e as E3s (ubiquitina-ligases), que reconhecem e transferem ubiquitina para o substrato, que, posteriormente, poderá ser destinado à degradação via proteassoma. Em mamíferos, a maior e mais bem estudada classe de E3 ligases são as multi-subunidades do tipo CRLs (Cullin RING-ligases), que são formadas pela união das proteínas SKP1, Cullin1, RBX1 e uma proteína do tipo F-box. Em protozoários parasitas, a proteólise intracelular é fundamental para a alternância de hospedeiros em seus ciclos de vida e consequente sucesso do parasitismo. Em parasitos do gênero Leishmania, causadores das leishmanioses, um grupo de doenças infecciosas negligenciadas que afetam milhões de pessoas, o SUP possui relevância fundamental para garantir a homeostasia celular e proliferação desses parasitos, sendo atualmente considerado alvo farmacológico para o tratamento de leishmanioses. No entanto, apesar da importância do SUP em Leishmania spp., não existem estudos de caracterização das enzimas E3 ubiquitina-ligases do tipo CRLs (Cullin RING-ligases) em parasitos deste gênero. Deste modo, nosso grupo de pesquisa busca caracterizar bioquimicamente os genes de L. infantum LINF_110018100, LINF_210005300 e LINF_240029100 que são ortólogos aos genes humanos SKP1, RBX1 e CUL1 respectivamente. Em análises in silico, observamos que estes genes de Leishmania spp. apresentam um alto grau de identidade com seus ortólogos humanos, especialmente em regiões de interação, sugerindo uma possibilidade de existência destes complexos no parasito. Por isso, propomos este projeto com o objetivo de avaliar se os genes do parasito são expressos e capazes de montar os complexos CRLs em células humanas. Para isso, clonaremos os genes de L. infantum LINF_110018100, LINF_210005300 e LINF_240029100 em vetores pcDNA3.1(+) para geração dos clones pcDNA3.1(+)-Linf-SKP-FLAG, pcDNA3.1(+)-Linf-Cullin 1-myc e pcDNA3.1(+)-Linf-RBX-HA. Em seguida, utilizaremos células de mamíferos (HEK293T) transfectadas com estes vetores e realizaremos imunoprecipitação com agarose-anti-FLAG e analisaremos os eluatos por SDS-PAGE e western blotting. Os resultados deste projeto poderão sugerir a presença das CRLs em Leishmania spp. e contribuirão para o conhecimento da fisiologia deste parasito e a sua relação com o hospedeiro, podendo levar a identificação de novos alvos para intervenção farmacológica visando o tratamento da leishmaniose.