Desenvolvimento de biossensores baseado na tecnologia CRISPR para detecção de genes característico de doenças

• Processo: 23/09451-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2023
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Exatas e da Terra - Química - Química Analítica
• Acordo de Cooperação: CNPq - INCTs
• Pesquisador responsável: Lauro Tatsuo Kubota
• Beneficiário: Bruna Maria Hryniewicz
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 14/50867-3 - INCT 2014: Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Bioanalítica, AP.TEM
• Assunto(s): Eletroanalítica Métodos bioanalíticos Técnicas biossensoriais Eletroquímica Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas Diagnóstico Doenças
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: bioanalítica | biossensor | Eletroquímica | Tecnologia CRISPR | Eletroanalítica

Resumo

Os complexos CRISPR, do inglês clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated systems, são um tipo de sistema imune adaptativo encontrado em bactérias que funciona principalmente visando a clivagem de sequências invasivas de DNA. O mecanismo simplificado pelo qual o sistema CRISPR/Cas atua, consiste no processo que após a entrada na célula pela primeira vez do DNA invasor, o mesmo é degradado e incorporado em locais específicos do material genético hospedeiro na forma de espaçadores, a partir da clivagem de sua sequência de ácidos nucleicos em pequenos pedaços. Uma vez incorporados ao genoma da bactéria, esses espaçadores passam a ser transcritos, ocorrendo posteriormente um processamento em vários RNAs menores cada qual com um espaçador, chamado de crRNA (CRISPR-derived RNA). Posteriormente, o crRNA forma um complexo de interferência com a proteína Cas9 que é capaz de reconhecer e destruir a sequência exógena, no caso de uma segunda invasão, terminando com a infecção antes mesmo dela começar.A compreensão do funcionamento desse mecanismo, levou a um grande potencial científico e tecnológico decorrente da possibilidade de direcionar a endonuclease pelo seu RNA guia, para a clivagem de alvos específicos, tornando-se uma importante ferramenta também para o diagnóstico de doenças e biomarcadores. Embora, algumas plataformas interessantes tenham sido desenvolvidas com a Cas9, a descoberta das proteínas Cas13a e Cas12a revolucionaram o campo de detecção de ácidos nucleicos. Essas enzimas, Cas12a e Cas13a possuem atividade de DNase/RNase de clivagem trans (colateral) adicional que atuam em sequências ss/sdDNA e ssRNA, respectivamente, não-alvo circundantes, ativadas pela presença das sequências alvo. A propriedade de clivagem colateral dessas enzimas é o princípio básico para ferramentas de diagnósticos. A combinação desse mecanismo de clivagem das endonucleases com outros métodos de amplificação permitiram o desenvolvimento de técnicas para detecção de doenças, nos quais os sistemas CRISPR/Cas servem como componentes biomoleculares programáveis e integrados que alcançam o reconhecimento preciso, além de elevada sensibilidade para biossensoriamento. Dessa forma, utilizando a tecnologia CRISPR, baseada nas endonucleases Cas12a e Cas13a, o presente projeto visa o desenvolvimento de uma plataforma universal para aplicação em biossensores eletroquímicos altamente sensíveis e seletivos para a determinação simultânea de material genético de vírus e bactérias a partir de uma abordagem simples para construção de dispositivos point-of-care. Primeiramente, os ácidos nucleicos, biomarcadores, receptores e sondas eletroquímicas serão devidamente projetados e confeccionados. Os oligunocleotídeos compatíveis com o biomarcador desejável serão selecionados e imobilizados na plataforma sensora, obtendo-se um biossensor baseado em CRISPR/Cas. Todas as etapas serão otimizadas e devidamente caracterizadas. O estudo começará com a detecção dos biomarcadores de DNA alvo da bactéria utilizando a enzima Cas12a. Serão desenvolvidos em primeira etapa, os biossensores de marcador único. Depois de estabelecidos os biomarcadores, os métodos de análise propostos serão estudados na presença de material genético em solução tampão, amostra biológica artificial ou soro de sangue humano. Além disso, a validação do sensor será realizada com as técnicas de ELISA e PCR. Seguida a construção primária do biossensor serão realizados estudos de modificação da superfície do eletrodo com nanopartículas metálicas e materiais a base de carbono (grafeno, óxido de grafeno, MWCNT), a fim de avaliar aumento da sensibilidade para o biossensor e imobilização das sequências de ssDNA e ssRNA na superfície do sensor. Por fim, com a plataforma do sensor já desenvolvida e fundamentada, testes de aplicação em dispositivos impressos serão conduzidos para a construção de um sistema point-of-care simples e barato para detecção de material genético. (AU)