Estudo dos mecanismos envolvidos na redução da sinalização da endotelina-1 no leito vascular de camundongos espontaneamente diabéticos

• Processo: 23/09528-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2023
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Farmacologia - Farmacologia Cardiorenal
• Pesquisador responsável: Rita de Cassia Aleixo Tostes Passaglia
• Beneficiário: Carina Amarante Pedersoli
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 13/08216-2 - CPDI - Centro de Pesquisa em Doenças Inflamatórias, AP.CEPID
• Bolsa(s) vinculada(s): 24/07580-7 - Impacto do aumento da concentração de glicose e insulina no perfil de dessensibilização e tráfico endossomal de ETAR e ETBR., BE.EP.MS
• Assunto(s): Dessensibilização Diabetes mellitus Endotelina-1 Sinalização intracelular
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: dessensibilização | diabetes | Endotelina-1 | Etar | Sistema Vascular | Sinalização intracelular

Resumo

O Diabetes Mellitus (DM) é um dos principais fatores de risco para várias doenças cardiovasculares como a hipertensão arterial, aterosclerose, acidente vascular cerebral, doença arterial coronariana e insuficiência cardíaca. O DM também promove complicações macro e microvasculares, como doença arterial periférica, retinopatia, isquemia e amputação de membros, sendo estas as grandes responsáveis pela redução da expectativa de vida dos portadores desse distúrbio metabólico. O estado hiperglicêmico modula negativamente vários fatores regulatórios da atividade de células endoteliais vasculares, gerando disfunção e diminuindo sua capacidade de responder a estímulos humorais e mecânicos. As alterações produzidas pela hiperglicemia na liberação de fatores dilatadores e constritores pelas células endoteliais comprometem o ajuste fino do tônus vascular, com consequente aumento na resistência vascular periférica, contribuindo para lesões em órgãos como os rins, coração, olhos e cérebro. Pacientes diabéticos e modelos experimentais de DM apresentam aumento da concentração plasmática de endotelina-1 (ET-1). No DM, também ocorre redução da resposta contrátil a concentrações crescentes de ET-1, como observado em artérias de resistência de camundongos espontaneamente diabéticos db/db, em camundongos com diabetes induzida por estreptozotocina e em pacientes diabéticos. Considerando os avanços recentes no estudo dos mecanismos envolvidos no controle da sinalização por receptores, como a existência de vias canônicas (que envolvem. ativação de proteínas G) e vias não canônicas (ativadas, por exemplo, pelo recrutamento de beta-arrestina e MAPKs), o objetivo deste trabalho é investigar os mecanismos envolvidos na redução das respostas vasculares a ET-1. Testaremos a hipótese que o aumento da concentração plasmática de ET-1 reduz a resposta contrátil mediada por receptores de endotelina do tipo A (ETAR) por aumentar preferencialmente sua degradação endossomal. Utilizaremos artérias mesentéricas de resistência de camundongos db/db e respectivos camundongos controle (db/+), bem como células epiteliais de rim humano (HEK293T), as quais permitem investigar mecanismos de sinalização intracelular, com expressão heteróloga de receptores acoplados a proteína G e ensaios de luminescência, como BRET. Inicialmente, a concentração plasmática de ET-1 e a transcrição dos genes associados à via de sinalização da ET-1 em artérias mesentéricas serão quantificadas por ELISA e qRT-PCR, respectivamente. Artérias serão expostas a ET-1, e a resposta contrátil e a dessensibilização do ETAR serão testadas por ensaios de reatividade vascular (artérias mesentéricas de resistência de camundongos db/db e db/+), na presença de cloroquina (para inibir a fusão da vesícula endossomal com vesículas lisossomais e a degradação do receptor). Células HEK293T expressando o ETAR humano serão expostas a ET-1 e medidas de alterações dos níveis de cálcio intracelular, na presença de veículo ou dos moduladores citados acima serão realizadas. Por fim, sob essas mesmas condições experimentais, as células serão submetidas a ensaios de BRET para caracterização do tráfego endossomal e monitoramento da reciclagem do receptor após internalização.