Produção por expressão heteróloga em Pichia pastoris e avaliação de eficácia de um fator de crescimento endotelial vascular e de uma serinoprotease de peçonha de serpente, para produção de um novo biopolímero com capacidade adesiva

• Processo: 23/11264-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2023
• Situação: Interrompido
• Área de conhecimento: Ciências da Saúde - Farmácia - Análise Toxicológica
• Pesquisador responsável: Eliane Candiani Arantes Braga
• Beneficiário: Isabela Gobbo Ferreira
• Instituição Sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 21/11936-3 - Centro de Ciência Translacional e Desenvolvimento de Biofármacos, AP.CCD
• Bolsa(s) vinculada(s): 24/14618-0 - Avaliação funcional do CdtVEGF, o fator de crescimento endotelial vascular da peçonha da cascavel brasileira Crotalus durissus terrificus, BE.EP.PD
• Assunto(s): Toxicologia Venenos de origem animal Proteínas recombinantes Fatores de crescimento do endotélio vascular Pichia pastoris Serina proteases Biopolímeros
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: biopolimero | Collineína-1 | Proteinas recombinantes | Vegf | Toxinologia

Resumo

As peçonhas de serpentes são consideradas ricas fontes de componentes dentre eles, enzimas, peptídeos e proteínas não-enzimáticas. Suas diferentes ações induzem um amplo espectro de efeitos, que variam desde distúrbios no sistema de coagulação à necrose e inflamação. Ainda, existem relatos de moléculas presentes nas peçonhas de serpentes que aumentam a permeabilidade vascular, induzem a proliferação e migração de células específicas, que podem auxiliar no processo de reparo tecidual. Essas moléculas são os fatores de crescimento endotelial vascular (VEGFs), uma classe de proteínas homodiméricas com oito resíduos de cisteínas altamente conservados em todas as seis proteínas dessa classe: VEGFs A, B, C e D os chamados VEGFs endógenos, VEGF-E identificado no genoma de um vírus e os VEGF-Fs identificados em peçonhas de serpentes. Estas moléculas são estrutural e funcionalmente muito similares, diferindo na capacidade de ligação e ativação dos receptores para VEGFs expressos em diferentes células, como monócitos, fibroblastos e células endoteliais vasculares. Os VEGF-Fs diferem dos VEGFs endógenos por apresentarem uma região de ligação a heparina na porção C-terminal da molécula e por não apresentarem glicosilações São proteínas menores (entre 20 e 30 kDa) e mais solúveis que os VEGFs-A. Os VEGFs interferem na cicatrização de feridas, por induzirem a deposição de colágeno, a re-epitelização do vaso além de induzir migração de células endoteliais vasculares, levando ao crescimento de novos vasos por meio do restabelecimento de angiogênese. O selante de fibrina comercial é um agente homeostático e adesivo composto por fibrinogênio concentrado e trombina extraídos do sangue humano e de custo elevado. Diversos tipos de selantes têm sido desenvolvidos com o objetivo de substituir suturas, evitando complicações como fistulas, isquemias de tecidos ou laceração de áreas inflamadas. O Centro para o Estudo de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP) desenvolveu um selante heterólogo de fibrina, com ensaios pré-clínicos e clínicos de fase I e II já concluídos. Este selante apresenta em sua composição uma serinoprotease, purificada da peçonha da serpente Crotalus durissus terrificus, um crioprecipitado rico em fibrinogênio extraído do plasma de búfalos e o diluente cloreto de cálcio, que polimeriza in situ. A rCollineína-1 é uma serinoprotease recombinante da peçonha de Crotalus durissus collilineatus com ação fibrinogenolítica. Portanto, ela possui potencial aplicação para o3Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos - CEVAP/UNESPRodovia Alcides Soares, Km 3, CEP 18.610-034, Fazenda Experimental Lageado, Botucatu, SPFone: (14) 3880-7241, 3880-7108, 3814-5446 e 3814-5555www.cevap.org.br [e-mail] de um novo biopolímero com capacidade adesiva. A purificação das toxinas em sua forma nativa apresenta um baixo rendimento, com consequente baixa recuperação (para o VEGF entre 0,5 e 2% e para a Collineína-1 entre 1 e 2%). Ou seja, a obtenção de ambas as proteínas através da expressão heteróloga irá viabilizar sua produção em maior escala com baixo custo. Sendo assim, o atual projeto tem como objetivo a produção do VEGF e da collineína-1 por meio de expressão heteróloga em escala ampliada, em sistema de levedura Pichia pastoris, visando o desenvolvimento de um novo biopolímero com capacidade adesiva e escalabilidade comercial. Além disso, o projeto visa realizar a PEGlação (modificação de biomoléculas pela conjugação covalente com polietilenoglicol - PEG, um polímero não tóxico e não imunogênico) das moléculas de VEGF e collineina-1, para melhorar seu uso como biofármaco, e realizar suas caracterizações estrutural, bioquímica e funcional. Serão analisadas as eficiências do VEGF recombinante em intensificar a migração celular (ensaios in vitro) e a do novo biopolímero em acelerar a regeneração óssea em modelo animal. (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

WIEZEL, GISELE A.; OLIVEIRA, ISADORA S.; REIS, MOUZARLLEM B.; FERREIRA, ISABELA G.; CORDEIRO, KALYNKA R.; BORDON, KARLA C. F.; ARANTES, ELIANE C.. The complex repertoire of Tityus spp. venoms: Advances on their composition and pharmacological potential of their toxins. Biochimie, v. 220, p. 23-pg., 2024-01-11. (23/11264-0, 21/11936-3, 20/13176-3, 22/08964-8, 23/01083-9, 23/10400-8)